雷公藤多苷對大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的時(shí)間治療學(xué)研究.pdf

1、目的：在觀察膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠相關(guān)炎性細(xì)胞因子晝夜節(jié)律特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察TG對CIA大鼠炎性因子晝夜節(jié)律的影響以及甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、來氟米特（leflunomide，LEF）、TG對CIA大鼠時(shí)間治療作用及其機(jī)制，為臨床的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法：
　　1實(shí)驗(yàn)分組及處理
　　1.1第一部分：雌性Wistar大鼠80只

2、置于時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，固定光照( L）∶黑暗（D）時(shí)間（L∶D=12∶12，明期為07:00～19:00，暗期為19:00～07:00）。將80只隨機(jī)分入空白組30只，模型組50只。適應(yīng)飼養(yǎng)10天后建立CIA模型，觀察造模21d后，記錄成模大鼠踝關(guān)節(jié)和足爪腫脹度。第42d，分別于授時(shí)時(shí)間（zeitgeber time，ZT,以ZT0為光照開始）ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22，6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分別平均處死大鼠，采血、

3、留取病變關(guān)節(jié)。
　　1.2第二部分：雌性Wistar大鼠120只置于時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，固定光照（L）∶黑暗（D）時(shí)間（L∶D=12∶12，明期為07:00～19:00，暗期為19:00～07:00），自由攝食飲水。將60只大鼠按照大鼠藥物干預(yù)時(shí)間不同，分為授時(shí)時(shí)間TG-ZT6組與TG-ZT18組，每組60只。適應(yīng)飼養(yǎng)10天后建立CIA模型，觀察造模21d后，選取成模CIA大鼠開始進(jìn)行藥物干預(yù)，TG組灌胃（40mg/kg），每日給藥

4、。記錄大鼠踝關(guān)節(jié)和足爪腫脹度。藥物干預(yù)42d，分別于ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22，6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分別平均處死大鼠，采血、留取病變關(guān)節(jié)。1.3第三部分：雌性Wistar大鼠120只置于時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，固定光照（L）∶黑暗（D）時(shí)間（L∶D=12∶12，明期為07:00～19:00，暗期為19:00～07:00）。隨機(jī)將標(biāo)記大鼠分入空白組8只，模型組16只，雷公藤多苷組（TG）32只，甲氨蝶呤組（MTX）32只，

5、來氟米特組（LEF）32只。適應(yīng)飼養(yǎng)10d后建立CIA模型，觀察造模21d后，選取成模CIA大鼠開始進(jìn)行藥物干預(yù)，MTX組灌胃（0.1mg/kg），TG組灌胃（40mg/kg），LEF組灌胃（2mg/kg），空白組與模型組均以等量3％羧甲基纖維素鈉灌胃。MTX隔日給藥，其余藥物均為1/日，持續(xù)給藥42d。記錄CIA模型大鼠踝關(guān)節(jié)和足爪腫脹度。干預(yù)結(jié)束后，采血、留取病變關(guān)節(jié)。
　　2實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1每3d使用游標(biāo)卡尺法測量

6、大鼠踝關(guān)節(jié)直徑和足爪厚度。
　　2.2 ELISA方法檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）及白介素-17a（interleukin-17a，IL-17a）表達(dá)水平。
　　2.3免疫組織化學(xué)方法檢測病變關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞IL-6、IL-17a、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix matallprotein-3，MMP-3）、TNF

7、-α、CLOCK及BMAL1表達(dá)水平；顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)。
　　2.4藥物干預(yù)41d拍雙足爪X線正位片，觀察影像學(xué)進(jìn)展。
　　2.5各組正態(tài)分布計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（x±s）差表示。組間差異采用多樣本均數(shù)的方差分析進(jìn)行判斷，兩兩均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行判斷。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1 CIA大鼠相關(guān)炎性因子晝夜節(jié)律特點(diǎn)
　　1.1各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度變化
　　CIA大鼠隨著

8、造模時(shí)間的延長，關(guān)節(jié)腫脹度呈現(xiàn)先逐漸增加，后緩慢降低的趨勢。模型組CIA大鼠初次免疫33d時(shí)，踝關(guān)節(jié)腫脹最為嚴(yán)重；初次免疫39d時(shí)，掌指關(guān)節(jié)腫脹最為嚴(yán)重。
　　1.2CIA大鼠模型血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量
　　各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CIA大鼠模型血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。空白組大鼠一晝夜內(nèi)IL-17a、IL-6及TNF-α血清水平穩(wěn)定；IL-17a、IL-6及TNF-α三種炎性因子在一晝夜內(nèi)呈

9、現(xiàn)相近的波動(dòng)特點(diǎn)：夜晚血清含量水平升高，白天血清水平降低。其中IL-17a在ZT18開始上升，并且于ZT22達(dá)到峰值；在ZT2開始下降，并且于ZT6達(dá)到谷值。IL-6在ZT14開始上升，并且于ZT22達(dá)到峰值；在ZT2開始下降，并且于ZT6進(jìn)入平臺(tái)期。TNF-α在ZT14開始上升，并且于ZT22達(dá)到峰值；在ZT2開始下降，并且于ZT6進(jìn)入谷值。
　　1.3各組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)X線觀察
　　各組大鼠踝關(guān)節(jié)X線攝片結(jié)果差異較大。

10、其中空白組大鼠踝關(guān)節(jié)X線觀察踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面清晰，掌指關(guān)節(jié)骨皮質(zhì)完整，關(guān)節(jié)間隙未見異常。模型組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面模糊，骨缺損明顯，掌指關(guān)節(jié)可見大塊骨缺損，關(guān)節(jié)間隙改變。
　　1.4各組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色及免疫組織化學(xué)觀察
　　空白組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色可見滑膜平滑，1-2層滑膜細(xì)胞，無乳突狀突起或增生，未見多核細(xì)胞浸潤。模型組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色可見滑膜細(xì)胞增生嚴(yán)重，乳突狀凸起，大量炎細(xì)胞浸潤。通過免疫組織化學(xué)檢測觀

11、察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠滑膜細(xì)胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達(dá)量均明顯高于空白組表達(dá)。
　　2雷公藤多苷對CIA大鼠相關(guān)炎性因子晝夜節(jié)律的影響
　　2.1各組CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度值變化
　　干預(yù)42d各組CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度變化各不相同，隨著造模時(shí)間的延長，CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度逐漸增加。兩時(shí)間治療組相比較，觀察第42dTG-ZT18組踝關(guān)節(jié)直徑及足爪厚度腫脹抑制程度顯著優(yōu)于TG-ZT

12、6組（P＜0.05），在持續(xù)觀察時(shí)間內(nèi)， TG-ZT18足爪厚度變化曲線始終位于TG-ZT6組曲線之下。
　　2.2各組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量
　　干預(yù)42d各時(shí)間治療組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。與TG-ZT6組比較，TG-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。
　　2.3各組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)X線觀察
　　兩

13、組大鼠踝關(guān)節(jié)X線攝片結(jié)果有明顯不同。TG-ZT6組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)破壞，關(guān)節(jié)面模糊，部分關(guān)節(jié)可見骨缺損。TG-ZT18組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面尚可見，左足改變較輕，少部分掌指關(guān)節(jié)骨破壞，關(guān)節(jié)間隙輕度改變。
　　2.4各組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色及免疫組織化學(xué)觀察
　　TG-ZT6組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色可見滑膜細(xì)胞增生，乳突狀凸起，大量炎細(xì)胞浸潤；TG-ZT18組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色可見滑膜細(xì)胞增生較輕，乳突狀凸起

14、，少量炎細(xì)胞浸潤。免疫組織化學(xué)檢測觀察發(fā)現(xiàn)TG-ZT18組大鼠滑膜細(xì)胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達(dá)量均明顯高于TG-ZT6組表達(dá)。
　　3 MTX、LEF和TG對CIA大鼠時(shí)間治療及其機(jī)制
　　3.1各組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度值變化
　　干預(yù)42d各組CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度變化各不相同。與模型組相比較，MTX組、LEF組及TG組腫脹度均明顯下降（P＜0.05）；其中踝關(guān)節(jié)腫脹

15、度以MTX下降最為明顯，足爪厚度以LEF組下降最為明顯。干預(yù)第42dMTX-ZT18組腫脹度明顯低于MTX-ZT6組（P＜0.05），干預(yù)第21d之后MTX-ZT18組整體腫脹度曲線在MTX-ZT6之下；干預(yù)第42d，與TG-ZT6組相比較，TG-ZT18組腫脹度也顯著降低（P＜0.05），但是TG-ZT6組起效較慢，而TG-ZT18組變化趨勢整體在TG-ZT6組之下；干預(yù)第42d，LEF-ZT6組與LEF-ZT18組相比較，無顯著差異

16、（P＞0.05）。
　　3.2各組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量
　　干預(yù)42d各時(shí)間治療組CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。與模型組比較，兩MTX時(shí)間治療組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量均顯著下降（P＜0.05）；與MTX-ZT6比較，MTX-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，兩LEF時(shí)間治療組血清IL-

17、17a、IL-6及TNF-α含量均顯著下降（P＜0.05），與LEF-ZT6組相比較，LEF-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量均無顯著差異（P＞0.05）。與模型組比較，TG-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯下降（P＜0.05），TG-ZT6組與模型組相比較血清IL-6與TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），血清IL-17a水平卻與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）；與TG-ZT6組比較，

18、TG-ZT18組血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。
　　3.3各組大鼠踝關(guān)節(jié)X線攝片
　　各組大鼠踝關(guān)節(jié)X線攝片結(jié)果差異較大。其中正常組大鼠踝關(guān)節(jié)X線觀察踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面清晰，掌指關(guān)節(jié)骨皮質(zhì)完整，關(guān)節(jié)間隙未見異常。模型組CIA踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面模糊，骨缺損明顯，掌指關(guān)節(jié)可見大塊骨缺損，關(guān)節(jié)間隙改變。MTX-ZT6組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)破壞，關(guān)節(jié)面模糊，部分掌指關(guān)節(jié)可見骨缺損。MTX-ZT18組CIA大

19、鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面尚可見，左足改變較輕，少部分掌指關(guān)節(jié)骨破壞，關(guān)節(jié)間隙輕度改變。LEF-ZT6組與LEF-ZT18組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面均可見，未見明顯骨破壞。TG-ZT6組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)破壞，關(guān)節(jié)面模糊，部分關(guān)節(jié)可見骨缺損。TG-ZT18組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面尚可見，左足改變較輕，少部分掌指關(guān)節(jié)骨破壞，關(guān)節(jié)間隙輕度改變。
　　3.4各組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色及免疫組織化學(xué)觀察
　　空白組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色可見滑膜平

20、滑，1-2層滑膜細(xì)胞，無乳突狀突起或增生，未見多核細(xì)胞浸潤。模型組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色可見滑膜細(xì)胞增生嚴(yán)重，乳突狀凸起，大量炎細(xì)胞浸潤。TG組、LEF組和MTX組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色可見滑膜細(xì)胞均有不同程度增生和炎細(xì)胞浸潤；同時(shí)TG-ZT18、LEF-ZT18、MTX-ZT18組分別與TG-ZT6、LEF-ZT6、MTX-ZT6比較滑膜細(xì)胞增生均較輕和炎細(xì)胞浸潤減少。免疫組織化學(xué)檢測大鼠踝關(guān)節(jié)觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠滑膜細(xì)胞IL-17

21、a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達(dá)水平均明顯高于空白組；TG組、LEF組和MTX組CIA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達(dá)水平與模型組相比較明顯降低；同時(shí)TG-ZT18、LEF-ZT18、MTX-ZT18組分別與TG-ZT6、LEF-ZT6、MTX-ZT6比較滑膜細(xì)胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表達(dá)量均有不同