VCIP IRES介導(dǎo)的人溶菌酶與牛γ干擾素共表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列是一種能夠獨(dú)立招募核糖體以表達(dá)蛋白的雙順反子序列，在構(gòu)建多基因共表達(dá)載體的過程中發(fā)揮著重要作用。溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一種能夠水解細(xì)胞壁內(nèi)粘多糖的堿性酶，具有很廣的抗菌譜，能夠溶解革蘭氏陽性細(xì)菌和部分革蘭氏陰性細(xì)菌，甚至病毒也有一定的滅活作用。牛γ-干擾素（BoIFN-γ）是細(xì)胞在受到適宜的刺激時(shí)，在特定的誘生劑作用下，分泌的一種微量的具有抗病毒、影響細(xì)胞生長分化、抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫功能的糖

2、蛋白。因此，LYZ與BoIFN-γ的聯(lián)合使用對(duì)于奶牛乳房炎的防治具有很高的利用價(jià)值。綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是一種由238個(gè)氨基酸組成的具有獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制的蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于水母中，是新型的報(bào)告基因和定位標(biāo)記物。腺病毒穿梭載體(Ad vector)因其外源基因表達(dá)效率高、瞬間表達(dá)，安全性好和易獲得高病毒滴度的載體等特點(diǎn)，在基因工程上受到了廣泛的應(yīng)用。
　　為了獲得能高效表達(dá)人溶菌酶(

3、hLYZ)與牛γ干擾素（BoIFN-γ）的雙表達(dá)腺病毒載體，本實(shí)驗(yàn)分別從人和鼠的基因組中克隆出人膠原誘導(dǎo)蛋白(hVCIP) IRES序列，命名為hIRES和鼠膠原誘導(dǎo)蛋白(mVCIP) IRES序列，命名為mIRES;從含有人溶菌酶基因(hLYZ)的pCDNAK-LYZ載體上PCR擴(kuò)增出hLYZ序列;從含有GFP基因的pEGFP-N1載體上擴(kuò)增出GFP序列。經(jīng)測序正確后，分別插入腺病毒穿梭載體Pshuttle-cmv的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建獲得

4、Pshuttle-hLYZ-hIRES-GFP和Pshuttle-hLYZ-mIRES-GFP兩種重組腺病毒載體。用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染PK15、AAV293和牛腎細(xì)胞，經(jīng)熒光顯微鏡觀察和FACS檢測，結(jié)果顯示，兩種IRES均成功介導(dǎo)了下游基因GFP的表達(dá)，不同的細(xì)胞中，報(bào)告基因GFP的表達(dá)量存在較大差別。用BoIFN-γ替換GFP基因，獲得Pshuttle-hLYZ-mIRES-BoIFN重組腺病毒載體，在AAV-293細(xì)胞內(nèi)包裝成腺病毒