海藻糖的生產(chǎn)工藝研究.pdf

1、這幾年，大腸桿菌廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)各種異源性蛋白，被認(rèn)為是可高效表達(dá)蛋白的系統(tǒng)。因其工程菌株體系具有遺傳背景研究透徹，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)密度高、蛋白表達(dá)量高、成本低和不易染菌這些特點，成為了工業(yè)化大量生產(chǎn)蛋白酶的選擇之一。
　　本論文通過在大腸桿菌中利用不同啟動子和不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)不同來源的海藻糖合酶，系統(tǒng)地對該基因工程體系與海藻糖合酶進行研究與探索，篩選出高效表達(dá)海藻糖合酶的重組大腸桿菌，進而提高海藻糖產(chǎn)量。較有代表性的選擇了三

2、種常溫來源和兩種嗜熱來源的TreS基因，分別利用大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn)，并且利用相應(yīng)的方法摸索酶學(xué)性質(zhì)，對海藻糖的產(chǎn)量進行測定。
　　本論文嘗試敲除大腸桿菌宿主編碼膜蛋白的1pp基因、利用分泌信號肽YebF與tttreS基因融合表達(dá)和tttreS基因截短的方法實現(xiàn)海藻糖合酶的胞外分泌。采用降低誘導(dǎo)表達(dá)溫度、更換較弱的重組質(zhì)粒上的啟動子和RBS序列和分子伴侶共表達(dá)的方法減少海藻糖合酶包涵體生成量，促進酶蛋白正確折疊，盡可能多地生成可溶性酶

3、。并且根據(jù)海藻糖合酶結(jié)構(gòu)同源模型建立探索酶催化活性中心和底物專一性周圍的關(guān)鍵性氨基酸，利用點突變技術(shù)改變tttreS的酶學(xué)性質(zhì)。利用這些對海藻糖合酶的改造技術(shù)，提高工業(yè)化海藻糖生成量。具體實驗結(jié)果為:
　　1、分別從三種常溫來源和兩種嗜熱來源的惡臭假單胞菌Pseudomonas putida NBRC14164，谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum ATCC13032，天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces

4、 coelicolor ATCC23899，嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus HB27和海棲熱袍菌Thermotogamaritime MSB8基因組中，克隆出其TreS基因，利用四種啟動子和拷貝數(shù)強度均不一樣的質(zhì)粒，構(gòu)建二十株含有不同TreS基因的重組大腸桿菌工程菌，篩選出高效表達(dá)海藻糖合酶的重組大腸桿菌，最高酶活為2614U，比酶活可達(dá)到1.996 U·mg-1，并對其進行誘導(dǎo)發(fā)酵條件和酶促反應(yīng)的優(yōu)化。確定最佳發(fā)酵條

5、件:發(fā)酵時間30 h、發(fā)酵溫度16℃、IPTG終濃度0.5 mM·L-1、誘導(dǎo)劑乳糖終濃度1.5 mM·L-1。最佳酶促反應(yīng)條件:酶反應(yīng)溫度50℃、酶反應(yīng)時間10 h、底物麥芽糖100g/L，酶反應(yīng)pH=9.0。金屬離子Ca2+添加量是15 mM·L-1，使酶活提高了19％，還原劑抗敗血酸和二硫蘇糖醇添加量是4 mM·L-1，使酶活分別提高了9.4％和41％。
　　2、利用Red重組將大腸桿菌宿主編碼膜蛋白的1pp敲除，使膜結(jié)構(gòu)疏

6、松，使海藻糖合酶分泌到胞外，發(fā)酵液上清反應(yīng)后的海藻糖濃度增加了1.48倍，菌體破碎反應(yīng)的海藻糖量有所下降。構(gòu)建分泌信號肽與海藻糖合酶基因融合表達(dá)的重組質(zhì)粒，使海藻糖合酶分泌到胞外，發(fā)酵液上清反應(yīng)后的海藻糖濃度提高了77.91％，發(fā)酵液上清和菌體破碎后反應(yīng)總海藻糖濃度提高了23.45％，一定程度上實現(xiàn)TreS的胞外分泌。降低誘導(dǎo)表達(dá)溫度和減弱重組質(zhì)粒上的啟動子或RBS序列強度有效減少了包涵體的生成，并且采用三種分子伴侶sigma32、Gr

7、oEL/S、DnaK/J單獨或隨機組合的形式與海藻糖合酶基因共表達(dá)又進一步提高可溶性酶蛋白表達(dá)量，最高可溶性表達(dá)的三種分子伴侶的組合與海藻糖合酶共表達(dá)的形式和原始菌株相比提高了12倍。并且根據(jù)海藻糖合酶結(jié)構(gòu)同源模型建立探索酶催化活性中心和底物專一性周圍的關(guān)鍵性氨基酸，利用點突變技術(shù)對其改造，提高TreS的酶活。
　　3、其他四種來源的TreS與嗜熱細(xì)菌來源的tttreS的C端融合表達(dá)，C端嗜熱部分對海藻糖合酶催化中心的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了作