犬松弛素原多克隆抗體的制備.pdf

1、松弛素(Relaxin，RLX)是由AB二鏈構(gòu)成的短肽鏈激素，歸屬于胰島素家族。松弛素具有廣泛的生理功能，包括生殖調(diào)控、舒張血管調(diào)節(jié)血循環(huán)、抗炎及促進(jìn)炎性反應(yīng)愈合等。目前對(duì)松弛素基因的研究主要集中在人、小鼠、豬等物種上，國外已克隆了犬前松弛素原(preprorelaxin)的基因序列，鑒于此，本研究以犬胎盤、卵巢組織為材料，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得多條犬前松弛素原基因cDNA，進(jìn)行克隆并作生物信息學(xué)分析，同時(shí)構(gòu)建犬松弛素原(prorel

2、axin)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，使其表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)。再將表達(dá)的重組蛋白免疫新西蘭兔以制備多克隆抗體。上述方法大程度的推動(dòng)了松弛素的結(jié)構(gòu)和功能的研究。本研究具體如下:
　　1、犬前松弛素原基因的克隆和生物信息學(xué)分析
　　本研究以北京犬和吉娃娃新生胎盤、貴賓犬卵巢為材料，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增前松弛素原基因，結(jié)果顯示:本實(shí)驗(yàn)完整克隆了從所獲樣品中擴(kuò)增到的預(yù)期大小目的片段，包含一個(gè)534 bp的開放閱讀框，編碼177個(gè)

3、氨基酸。將所擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分析顯示，與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫檢索的犬preprorelaxin的cDNA序列同源性為99.6％，均有3個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生改變，從而引起相應(yīng)氨基酸改變，但并未引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，所獲三條目的片段同為一支，與貓preprorelaxin基因的進(jìn)化距離最近。生物信息分析顯示，3條序列等電點(diǎn)、帶電荷數(shù)、最高最低氨基酸、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)一致，分子式分子量、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均疏水

4、指數(shù)有細(xì)微差異;跨膜區(qū)、信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果一致;二級(jí)結(jié)構(gòu)組成一致，包含α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲，比例存在細(xì)微差異。
　　2、犬松弛素原的原核表達(dá)及多克隆抗體制備
　　以從北京犬胎盤組織克隆的犬前松弛素原cDNA片段為模板，用特異引物克隆獲得松弛素原基因，長度為459 bp，后與帶有多聚組氨酸(6×His)的原核表達(dá)載體pET28a相連，成功轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR、酶切以及測(cè)序鑒定為陽性后，提取pET2

5、8a-prorelaxin重組質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21(DE3)中表達(dá);利用SDS-PAGE電泳和免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析菌體裂解液和培養(yǎng)上清液，結(jié)果顯示目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，目的蛋白分子量為22kD結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。以誘導(dǎo)表達(dá)菌體裂解液純化蛋白為免疫原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡(Western blotting)對(duì)免疫家兔血清進(jìn)行分析，結(jié)果顯示血清中犬松弛素原抗體效價(jià)達(dá)