人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細胞抗炎特性對帕金森病模型大鼠的神經(jīng)保護作用.pdf

1、背景：
　　 帕金森病(Parkinson's Disease，PD)是一種較為常見的中老年入神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為肢體運動性障礙。現(xiàn)有研究認為，PD的主要病變部位在中腦黑質(zhì)以及紋狀體區(qū)域，也有在蒼白球、殼核、尾狀核、丘腦底核、三腦室及大腦皮質(zhì)等處，病理上常表現(xiàn)為嚴重的中腦黑質(zhì)部多巴胺能神經(jīng)元喪失。對于其發(fā)病機制目前仍未明了?，F(xiàn)有研究表明PD仍是一種無法治愈性疾病，然而，治療可以明顯改善患者的生活質(zhì)量。目前臨床上針對這種

2、疾病主要有兩種治療手段，其一是藥物治療，這種方法是早期患者的首選治療手段，通過合理的藥物搭配及調(diào)整用量，多數(shù)患者在起病5年內(nèi)癥狀能夠得到有效控制，然而，隨著疾病的進展，治療將逐漸失效。其二是手術(shù)治療，20世紀初，主要的手術(shù)方式為核團毀損術(shù)，對于一些以肢體震顫表現(xiàn)為主的患者治療效果較好，然而，手術(shù)后并發(fā)癥較多。因而逐漸被腦深部電極刺激術(shù)(DBS)所取代。回顧性研究表明DBS手術(shù)療效至少在兩年內(nèi)是穩(wěn)定的，而且術(shù)后患者口服藥物用量減少。然而，

3、存在這樣一個問題:藥物治療和手術(shù)治療皆不能延緩疾病的進展。
　　 隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究人員開始探索通過細胞移植來延緩或抑制中腦黑質(zhì)部多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，從而恢復(fù)神經(jīng)環(huán)路中多巴胺遞質(zhì)的水平治療PD。干細胞作為一類可以在體內(nèi)和體外大量自我復(fù)制、并能夠持續(xù)保持不對稱分裂特性的細胞群，主要包括胚胎干細胞及成體干細胞。在干細胞移植治療PD的實驗中，各種干細胞均收到良好的治療效果。其中，間充質(zhì)干細胞(MSCs)作為一種成體干細胞，由于

4、其來源豐富，易獲取，已成為一種理想的種子細胞。已有研究表明間充質(zhì)干細胞移植治療PD確實能改善PD的癥狀。然而，其作用機制目前仍未完全明了。既往研究認為，MSCs的作用機制主要在兩個方面:其一，MSCs具有多向分化能力，在腦內(nèi)能夠定向分化多巴胺能神經(jīng)元，替代受損的神經(jīng)元;其二，MSCs能夠分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子（如:GDNF、NGF），改善殘存神經(jīng)元局部微環(huán)境，抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡。
　　 近年來，越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)炎癥反應(yīng)是

5、帕金森病發(fā)病的一個重要機制，而且小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)主要的固有免疫細胞在這一過程中具有重要的作用?；罨男∧z質(zhì)細胞能夠分泌多種炎性因子（如:TNF-α、IL-1β）促使多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)MSCs不僅具有較強的增殖及多向分化功能，而且具有免疫調(diào)節(jié)特性。這一點在一些免疫相關(guān)性疾病的研究中已經(jīng)得到充分證實。由美國國家健康中心資助的臨床試驗網(wǎng)報道稱，MSCs作為免疫調(diào)節(jié)劑的治療價值目前已經(jīng)在一些Ⅰ期，Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗中進行

6、探究，其中許多試驗最近已經(jīng)完成或正在進行中。由于其免疫抑制特性，研究者認為MSCs在維持外周耐受和誘導(dǎo)移植耐受方面具有重要的作用，并且認為MSCs是細胞移植治療GVHD、自身免疫性疾病和預(yù)防實體器官移植后排斥反應(yīng)的理想選擇。因而我們假設(shè)這樣一個事實:間充質(zhì)干細胞能否通過免疫調(diào)節(jié)特性抑制PD患者腦內(nèi)炎性細胞的活性，從而抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。
　　 本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)，人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細胞(hPDB-MSCs)具有和骨

7、髓來源的MSCs相似的形態(tài)學(xué)、免疫表型和功能特點。而且目前尚無hPDB-MSCs移植治療PD模型大鼠方面的研究。因而，本實驗擬通過將hPDB-MSCs靜脈移植入PD模型大鼠體內(nèi)，探討其對PD模型大鼠的影響并探討其能否通過抗炎機制改善PD大鼠癥狀。
　　 目的：驗證本課題組前期體外分離培養(yǎng)并純化的人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細胞(hPDB-MSCs)與其他間充質(zhì)干細胞一樣，同樣能夠發(fā)揮抗炎特性，同時探討hPDB-MSCs移植入PD模型大鼠

8、體內(nèi)能否抑制PD模型大鼠腦內(nèi)炎性細胞的活化以及一些炎性因子的分泌，從而抑制PD模型大鼠中腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，改善PD模型大鼠的癥狀。
　　 方法：
　　 1.hPDB-MSCs的復(fù)蘇及體外培養(yǎng):將凍存的hPDB-MSCs細胞移入37℃溫水中進行快速解凍并移入離心管，加入10倍體積的DMEM/F12培養(yǎng)基后將其置入離心機中1000rpm離心5min。去除上清液后用含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，按1

9、×106/L的密度接種子25T培養(yǎng)瓶中，置入37℃、5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次同進行換液，待細胞融合達到80％左右用0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，并定期在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。傳代3次后留取對數(shù)生長期細胞備用。
　　 2.PD模型大鼠的建立:術(shù)前給予腹腔注射阿樸嗎啡(APO:0.5mg/kg)淘汰出有旋轉(zhuǎn)行為的大鼠。在大鼠腦立體定向儀的引導(dǎo)下通過向大鼠腦右側(cè)中腦黑質(zhì)致密部以及腹側(cè)被蓋核團位置注入6-OHDA藥物

10、來誘導(dǎo)建立PD模型大鼠。注藥靶點主要是根據(jù)paxinos編著的《大鼠腦立體定向圖譜》來確定，注藥后通過APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗來評價模型是否成功。成功模型的評價標(biāo)準(zhǔn)為注藥10分鐘后開始計數(shù)半小時內(nèi)大鼠恒定向左旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)，一周一次，連續(xù)3周，若恒定向左平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞7r/min，則視為成功PD大鼠模型。
　　 3.分組及處理:將成功模型并隨機分為模型組與移植組。將用PBS重懸的hPDB-MSCs尾靜脈移植入移植組大鼠中，同時向模型組大鼠

11、注入等量體積的PBS。
　　 4.行為學(xué)檢測:對比觀察各組不同時間點（移植后3d、1周、2周及4周）的行為學(xué)改變。
　　 5.免疫組化檢測各組損傷側(cè)TH及Iba1的表達:將各時間點腦組織標(biāo)本進行石蠟包埋固定后進行切片，按照SP免疫組化試劑盒說明書行TH及Iba1免疫組織化學(xué)染色。主要檢測移植后3天、1周、2周及4周各組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)TH、Iba1表達。具體步驟如下:室溫下3％雙氧水孵育10min后PBS沖洗3min×3次

12、;正常山羊血清封閉液封閉15min后不沖洗;每張切片滴加50μl一抗，陰性對照組切片滴加等體積PBS，置入4℃冰箱中孵育過夜，PBS沖洗3min×3次;每張切片滴加50μl生物素化二抗（羊抗小鼠IgG），室溫下孵育15min后用PBS沖洗3min×3次;滴加50μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育15min，PBS沖洗3min×3次;DAB顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，及時用蒸餾水終止反應(yīng);切片復(fù)染、脫水透明后用中性樹脂封

13、片，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。每只大鼠每個指標(biāo)選取5張切片，在高倍鏡(×400)下同一背景下選取5個不同視野進行細胞計數(shù)，分別計數(shù)損傷側(cè)與健側(cè)TH、Iba1陽性細胞數(shù)，并計算出損傷側(cè)與健側(cè)陽性細胞百分比進行統(tǒng)計分析。
　　 6.Q-PCR檢測抗炎因子hIL10、hTGF-β及炎性因子TNF-α表達:各組大鼠麻醉后在冰面上快速斷頭取腦，切取前囟后4.4mm-7mm層面右側(cè)中腦黑質(zhì)部位腦組織，約黃豆大小。按照RNA提取純化試劑盒說明書

14、進行提取總RNA。取5μg總RNA作為模板按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按PCR試劑盒說明書方法，采用20μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃2min，變性95℃10s，退火60℃30s，延伸70℃30S，共進行40個循環(huán)。運用2-△△Ct法，得出其余各時間點移植組與模型組3d時間點表達量的倍數(shù)關(guān)系進行統(tǒng)計。
　　 7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計:數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　

15、 結(jié)果：
　　 1.hPDB-MSCs形態(tài):hPDB-MSCs在形態(tài)上與其他來源的MSCs基本一致，皆呈梭形成纖維細胞樣，旋渦狀生長。
　　 2.PD建模:建模成功率56.5％，PD模型大鼠常表現(xiàn)出豎毛、躬身、少動、行動遲緩等現(xiàn)象。
　　 3.hPDB-MSCs移植后1周、2周、4周，在APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實驗中發(fā)現(xiàn)，各時間點移植組大鼠APO誘導(dǎo)的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均低于模型組(P＜0.05)。腦組織切片免疫組化結(jié)果顯示

16、:移植組損傷側(cè)黑質(zhì)部位移植后4周TH陽性細胞數(shù)較移植后3d時明顯增加(P＜0.01)。與相應(yīng)時間點模型組相比，移植術(shù)后2周、4周移植組TH陽性細胞明顯增多(P＜0.05)，移植術(shù)后4周移植組黑質(zhì)部位活化小膠質(zhì)細胞減少。在mRNA水平，移植組hIL10及hTGF-β表達均較模型組增加，以移植后1周與2周時明顯(P＜0.05)，而TNF-α表達量則逐漸降低。
　　 結(jié)論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn)hPDB-MSCs作為一種新的間充質(zhì)