松脂素二葡萄糖苷對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPG以及RANKL表達(dá)的影響.pdf

1、目的：目前對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治問(wèn)題已經(jīng)引起全球的關(guān)注。迄今為止對(duì)骨質(zhì)疏松癥尚無(wú)特效藥物。國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，杜仲單體成分可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化并可上調(diào)成骨細(xì)胞OPG/RANKL的比值，但目前對(duì)杜仲的研究多關(guān)注于杜仲整體，對(duì)其單體及化合物成分的研究較少。本實(shí)驗(yàn)著眼于杜仲單體成分松脂素二葡萄糖苷對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的研究，應(yīng)用松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞，觀察其對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖分化的作用和對(duì)OPG及RANKL

2、表達(dá)的影響，進(jìn)而為松脂素二糖苷對(duì)骨質(zhì)疏松癥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)從松脂素二葡萄糖苷對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖、分化以及對(duì)其OPG以及RANKL表達(dá)的影響兩部分分別進(jìn)行。
　　第一部分:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入含不同濃度的松脂素二葡萄糖苷:0mg/ml、10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4×10-9mg/ml的含10％胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞，用MTT法確定松脂素二葡萄

3、糖苷培養(yǎng)液對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖作用。然后用以上三種濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞，檢測(cè)ALP的活性，以評(píng)價(jià)松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的分化作用。最后用茜素紅染色法顯微鏡下觀察三種不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的鈣化作用。
　　第二部分:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入含不同濃度的松脂素二葡萄糖苷:0mg/ml、10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4

4、×10-9mg/ml的含10％胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞，用半定量PCR法觀察三種不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的OPG和RANKL的轉(zhuǎn)錄情況，評(píng)價(jià)松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPG及RANKL表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分:(1)不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)期間，MC3T3-E1成骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡的情況。(2) MTT顯

5、示10-7mg/ml、2×10-8mg/ml、4×10-9mg/ml用藥各組與DMSO對(duì)照組和空白組比較，均能促進(jìn)MC3T3-E1的增殖，且差異具有顯著性(P＜0.01)。(3)松脂素二葡萄糖苷用藥各組與空白對(duì)照組以及DMSO對(duì)照組相比較，均能促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞分泌ALP，且具有顯著性差異（P＜0.05），呈濃度依賴(lài)性。10-7mg/ml組的ALP含量明顯高于空白組和DMSO組，差異具有顯著性(P＜0.01)。(4)松脂素二葡

6、萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)14天后，茜素紅染色結(jié)果顯示用藥各組染色較深，鈣結(jié)節(jié)含量豐富，而對(duì)照組及空白組染色較淺，鈣結(jié)節(jié)含量少，提示松脂素二葡萄糖苷能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。
　　第二部分:(1)不同濃度的松脂素二葡萄糖苷培養(yǎng)液培養(yǎng)期間，MC3T3-E1成骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡的情況。(2)通過(guò)對(duì)MC3T3-E1OPGmRNA表達(dá)的半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用藥各組與空白組及對(duì)照組相比較，光密度值明顯增加，差

7、異具有顯著性（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加，OPGmRNA的水平逐漸增加，提示松脂素二葡萄糖苷可以促進(jìn)MC3T3-E1OPGmRNA的表達(dá)，且具有濃度依賴(lài)性。(3)通過(guò)對(duì)MC3T3-E1 RANKL mRNA表達(dá)的半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用藥組與與空白組及對(duì)照組相比較，光密度值明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加，RANKL mRNA的水平逐漸降低，提示松脂素二葡萄糖苷可以促進(jìn)MC3T3-E1OPG

8、 mRNA的表達(dá)，且具有濃度依賴(lài)性。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法及檢測(cè)ALP的活性和茜素紅染色，證明了松脂素二葡萄糖苷對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化成熟及增殖所起到的重要作用。并且松脂素二葡萄糖苷可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)OPG，并抑制其表達(dá)RANKL，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化與成熟;同時(shí)進(jìn)一步研究了隨著藥物濃度的增加，OPG mRNA的表達(dá)逐漸增加而RANKL mRNA的表達(dá)逐漸減少，為篩選促進(jìn)骨形成的有效藥物提供了作用