降鈣素基因相關肽對血清饑餓條件下MC3T3-E1成骨細胞凋亡和自噬的影響.pdf

1、在骨折愈合過程中，成骨細胞是骨修復和骨重建最為重要的細胞之一，主要依賴于微環(huán)境中連綿不絕的營養(yǎng)供應及促生存信號才能維持其正常的生理功能;當骨組織發(fā)生病變或者損傷導致營養(yǎng)因子供應受到限制時，成骨細胞將會發(fā)生超出正常生理狀態(tài)的凋亡率，由此對骨的重塑造成了嚴重的影響。
　　研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)骨組織的各項生理功能，降鈣素基因相關肽（CGRP）作為廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)，對骨形成和骨吸收起著重要的作用。本課題組在前期研究中已經(jīng)

2、證實CGRP在頜骨骨折的愈合過程中起著重要的促進作用。成骨細胞表面存在CGRP受體，CGRP通過結(jié)合受體發(fā)揮對成骨細胞活性的直接調(diào)節(jié)作用，CGRP對成骨細胞的作用分子機制已有大量研究。近期研究證明CGRP能夠通過抑制成骨細胞的凋亡進而抑制骨的丟失，對成骨細胞具有潛在的保護作用，但具體機制尚不完全清楚。
　　自噬(autophagy)是一種細胞應對不利環(huán)境的一種自我保護機制，是將受損或異常的細胞器和蛋白質(zhì)通過雙層膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運發(fā)至溶酶體

3、降解循環(huán)再利用的過程。凋亡（apoptosis）是細胞受基因控制的一種主動的有序的死亡方式。骨折愈合過程中同時伴隨著凋亡與自噬的發(fā)生，兩者如何互相作用共同促進骨折愈合的具體機制尚不清楚。
　　目的：
　　本實驗旨在驗證CGRP對饑餓條件下成骨細胞抗凋亡作用，發(fā)現(xiàn)其對饑餓條件下成骨細胞自噬活性的影響作用，再對兩者相互的關系進行了初步的探索。首次從自噬入手，試圖進一步揭示CGRP對成骨細胞發(fā)揮保護作用的機制。
　　方法：<

4、br>　　成骨細胞于血清饑餓條件（α-MEM培養(yǎng)基、0％FBS、100U/ml青-鏈霉素）下培養(yǎng)12h、24h后通過流式細胞術和Western blotting分別檢測其凋亡率和自噬相關蛋白LC3的表達。自噬抑制劑3-MA預處理成骨細胞細胞1h后血清饑餓培養(yǎng)24h，采用流式細胞術檢測細胞凋亡。在血清饑餓條件下加入不同濃度的CGRP培養(yǎng)24h，采用Western blotting檢測LC3蛋白和P62蛋白，篩選出對自噬優(yōu)勢作用濃度;通過加

5、入CGRP后不同時間段采用Western blotting檢測LC3蛋白，篩選出CGRP作用于饑餓條件下成骨細胞自噬作用的優(yōu)勢作用時間段。CGRP作用于血清饑餓條件下培養(yǎng)成骨細胞24h，采用流式細胞術檢測細胞凋亡，并采用共聚焦激光顯微鏡觀察MDC染色細胞自噬體和LC3免疫熒光染色。在血清饑餓條件下使用自噬抑制劑抑制3-MA預處理細胞后加入CGRP培養(yǎng)24h，采用流式細胞術檢測細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.血清饑餓會誘導成骨

6、細胞凋亡率升高，通過Western blot檢測顯示血清饑餓會誘導成骨細胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高。
　　2.自噬抑制劑3-MA預處理可以增加血清饑餓條件下成骨細胞凋亡率。
　　3.CGRP可以抑制血清饑餓誘導成骨細胞的凋亡。CGRP作用于血清饑餓條件下成骨細胞24h，隨著加入CGRP濃度的逐漸升高，LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異逐漸上升，P62表達逐漸下降，在CGRP濃度為10-8mol/L是差異較為明顯。CGRP作用于血清饑餓條件下成

7、骨細胞不同時間段，在24h時LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異最為明顯。CGRP誘導血清饑餓條件下成骨細胞自噬體形成及LC3蛋白表達。
　　4.自噬抑制劑3-MA預處理后可以增加血清饑餓條件下成骨細胞的凋亡率，CGRP則能部分逆轉(zhuǎn)自噬抑制劑3-MA預處理后所致的血清饑餓條件下成骨細胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.本研究驗證血清饑餓會誘導成骨細胞凋亡及自噬活性的升高，抑制血清饑餓條件下成骨細胞的自噬活性會誘導凋亡率的升高。