自噬抑制氟誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1凋亡作用分析.pdf

1、目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)主要研究氟誘導(dǎo)成骨細(xì)胞MC3T3-E1發(fā)生自噬、凋亡,及兩者之間的關(guān)系。通過給予MC3T3-E1細(xì)胞不同濃度的氟,探討氟引起凋亡的具體的濃度,并在研究氟對凋亡的過程中能夠研究是否存在自噬,及自噬對凋亡的影響。
　　 材料和方法:
　　 1.利用MTT比色法檢測氟對成骨細(xì)胞MC3T3-El的增殖活性影響,探尋氟引起凋亡的濃度。
　　 MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.1ml

2、培養(yǎng)基,24h后細(xì)胞貼壁,更換培養(yǎng)液,分別加入不同濃度的氟化鈉,復(fù)合培養(yǎng)24,48小時后。加入MTT,酶標(biāo)儀測量490nm波長的吸光度值(OD)。分析細(xì)胞的增殖和凋亡情況。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。
　　 細(xì)胞提取后,經(jīng)PBS沖洗后,加入ANNEXIN-V染液10μL,及PI染液5μL,避光孵育10分鐘后,上機(jī)檢測。
　　 3.westernblot免疫印記技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白。
　　 加入蛋白

3、裂解液裂解。收集蛋白樣品后測定蛋白樣品的濃度,加入適量的上樣緩沖液,煮沸5分鐘后,冷卻到室溫后就可以上樣,將樣品加入到SDS.PAGE加樣空內(nèi)以恒壓80v跑電泳90-120分鐘,電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜上,采用恒流300mA轉(zhuǎn)膜2小時,封閉兩小時后,用相應(yīng)抗體孵育過夜,第二日清晨加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2小時,最后采用ECL,試劑來檢測。利用westernblot免疫印記技術(shù)檢測Beclin1蛋白及LC3蛋白表達(dá)水平及變化。<