自噬抑制氟誘導的成骨細胞MC3T3-E1凋亡作用分析.pdf

1、目的:
　　 本實驗主要研究氟誘導成骨細胞MC3T3-E1發(fā)生自噬、凋亡,及兩者之間的關系。通過給予MC3T3-E1細胞不同濃度的氟,探討氟引起凋亡的具體的濃度,并在研究氟對凋亡的過程中能夠研究是否存在自噬,及自噬對凋亡的影響。
　　 材料和方法:
　　 1.利用MTT比色法檢測氟對成骨細胞MC3T3-El的增殖活性影響,探尋氟引起凋亡的濃度。
　　 MC3T3-E1細胞接種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.1ml

2、培養(yǎng)基,24h后細胞貼壁,更換培養(yǎng)液,分別加入不同濃度的氟化鈉,復合培養(yǎng)24,48小時后。加入MTT,酶標儀測量490nm波長的吸光度值(OD)。分析細胞的增殖和凋亡情況。
　　 2.流式細胞術檢測細胞凋亡。
　　 細胞提取后,經(jīng)PBS沖洗后,加入ANNEXIN-V染液10μL,及PI染液5μL,避光孵育10分鐘后,上機檢測。
　　 3.westernblot免疫印記技術檢測凋亡相關蛋白。
　　 加入蛋白

3、裂解液裂解。收集蛋白樣品后測定蛋白樣品的濃度,加入適量的上樣緩沖液,煮沸5分鐘后,冷卻到室溫后就可以上樣,將樣品加入到SDS.PAGE加樣空內(nèi)以恒壓80v跑電泳90-120分鐘,電泳后轉到PVDF膜上,采用恒流300mA轉膜2小時,封閉兩小時后,用相應抗體孵育過夜,第二日清晨加入對應的辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2小時,最后采用ECL,試劑來檢測。利用westernblot免疫印記技術檢測Beclin1蛋白及LC3蛋白表達水平及變化。<