鋅協(xié)同三羥異黃酮對成骨細胞MC3T3-E1增殖的影響.pdf

1、骨質疏松是以骨量減少，骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。近年來骨質疏松發(fā)病率的逐年增高引起全世界的廣泛關注。絕經后婦女卵巢功能低下，雌激素分泌減少，骨轉換亢進，骨吸收大于骨形成，造成骨丟失，產生骨質疏松。由于雌激素缺乏是絕經后骨質疏松的首要病因，故雌激素替代療法是臨床上的一線療法。激素替代療法雖然能夠阻止絕經后婦女骨量的丟失，并且提高骨密度，但長期使用有促子宮內膜增生、增加冠心病、腦卒中、肺栓塞、

2、乳腺癌等發(fā)生率的危險。由于植物雌激素有雌激素樣作用而沒有雌激素的副作用，因此人們試圖用植物雌激素，如大豆異黃酮等來防治骨質疏松。
　　異黃酮由于在結構上與雌激素非常相似，所以其具有類雌激素或抗類雌激素的生理作用，它能夠模擬天然的雌激素，與雌激素受體競爭性結合，調節(jié)其活性。因此黃酮類化合物對激素依賴性的癌癥(如前列腺癌、子宮癌、乳腺癌等)的防治特別有效，并能延緩或減輕中老年婦女絕經期的各種癥狀。
　　植物雌激素具有雙重生物活性

3、，既能發(fā)揮促雌激素作用又能發(fā)揮抗雌激素作用，但其機理還不完全清楚。部分體內實驗顯示其生物活性是根據個體內源性雌激素含量來調節(jié)的。長期臨床試驗證明：異黃酮對低雌激素水平者，表現(xiàn)為弱的雌激素樣作用，可防治一些和雌激素水平下降有關的疾病，如更年期綜合癥、骨質疏松、高脂血癥等；對于高雌激素水平者，表現(xiàn)為抗雌激素活性，可防治乳腺癌、子宮內膜癌等，可見其對機體具有雙向調節(jié)平衡功能。攝入大量的大豆制品能使雌激素循環(huán)受抑，并影響絕經前婦女的月經周期。<

4、br>　　三羥異黃酮作為一種植物雌激素，其結構與雌激素相似，通過模擬雌激素作用可調節(jié)骨代謝，促進成骨細胞增殖和骨形成，并減少去除卵巢后骨量的丟失，產生防治骨質疏松的作用。
　　異黃酮防治骨質疏松的作用機制仍未完全清楚，但可明確的是ER是作用的關鍵因素。異黃酮通過細胞膜進入細胞核，與核ER受體結合，改變其構型，形成配基受體復合物二聚體，這種配基誘導的復合物與共調節(jié)蛋白（輔激活子或輔抑制子）結合，再與特定的DNA序列和亞序列結合，發(fā)生

5、組織或細胞特異性的基因表達。異黃酮無論是對骨、膽固醇代謝所表現(xiàn)的雌激素激動劑的效應還是在子宮及乳腺組織中所表現(xiàn)的拮抗劑的作用都與ER高親和力的相互作用有關。雌激素受體有兩種亞型，分別是ERα和ERβ，兩種亞型在人體許多組織和細胞都有分布，ERα在尿道、乳腺中占主導地位,而ERβ在骨骼、心血管、免疫系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)中高表達，異黃酮和ERα、ERβ結合，在不同的組織或在不同的生理條件下產生雌激素樣作用或抗雌激素樣作用。其組織選擇性作用的發(fā)

6、揮可由三種相互作用的機制來解釋：靶組織中兩種ER亞型表達的差異；不同配體結合引起的ER構型變化的差異；共調節(jié)蛋白表達水平的差異及與ER結合的種類數(shù)量的不同。有文獻報道，骨骼中，異黃酮在生理水平則選擇性作用于ERβ，與其親合力為ERα的20倍。異黃酮促進成骨細胞株MC3T3-E1細胞的增殖作用可能與ERβ激動有關。
　　鋅是動物機體必需的微量元素，除了參與生長發(fā)育、生殖和免疫等多種生理反應外，在骨骼代謝和相關功能基因表達方面也發(fā)揮重

7、要作用。Relea等認為鋅具有穩(wěn)定肥大細胞和抑制內源性肝素顆粒釋放的作用，而骨源性肝素與骨質疏松病理過程有關。鋅還可以協(xié)同細胞因子、雌激素等，調節(jié)骨細胞的代謝。Aitken通過對股骨的活檢測定骨鋅的含量，發(fā)現(xiàn)鋅與股骨密度密切相關。Fushimi等報道糖尿病鼠血鋅比對照組低，24h尿鋅排出量為對照組的3倍，通過檢測分析發(fā)現(xiàn)尿鋅增加與血漿、肝、腎內鋅下降無關，而與骨組織鋅含量減少有顯著關系?？傊?，骨質疏松是一種復雜的病變過程，而鋅作為微量元

8、素,既是骨的組分，又參與骨的代謝過程，臨床研究發(fā)現(xiàn)血清鋅和尿鋅與骨質疏松有相關性。鋅能夠促進成骨細胞從G0/G1期向S期轉化，加速細胞進入DNA合成期，從而促進DNA合成及細胞增殖。
　　實驗目的：
　　以成骨細胞MC3T3-E1為研究對象，研究不同劑量三羥異黃酮和鋅單獨、聯(lián)合作用對MC3T3-E1細胞增殖的影響，并通過研究細胞中堿性磷酸酶（ALP）、骨形成蛋白-2（BMP-2）表達的變化，探討鋅和三羥異黃酮對骨質疏松的防治

9、作用及其作用機制。
　　實驗方法：
　　細胞使用α-MEM培養(yǎng)基(含10％滅活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素)，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。根據實驗目的，將細胞分為以下六組：
　　(1)正常對照組：不加任何處理因素常規(guī)培養(yǎng)；
　　(2)溶劑對照組：培養(yǎng)液中加入DMSO，體積比為0.1％；
　　(3)陽性對照(E2)組：在培養(yǎng)液中加入E2，使終濃

10、度為1×10-9mol/L；
　　(4)Zn組：在培養(yǎng)液中加入Zn，終濃度分別為1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L；
　　(5)GS組：在培養(yǎng)液中加入GS，終濃度分別為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L；
　　(6)GS+Zn組：在GS組各濃度中分別加入終濃度為1×10-5mol/L的Zn。
　　將細胞接種于96孔培養(yǎng)

11、板(2×103個/孔)，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，按實驗分組于每孔加入不同濃度的各種受試物(總體積200μl/孔)，每一劑量組設8個復孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h，通過MTT比色實驗，檢測處理因素對MC3T3-E1細胞增殖的影響。
　　將細胞接種于6孔培養(yǎng)板(1×104個/孔)，24h后換含不同濃度受試物的α-MEM培養(yǎng)液。孵育72h后收集所有細胞，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。按ALP試劑盒操作步驟檢測MC3T3-E1

12、細胞中ALP的含量。應用Western blot法檢測三羥異黃酮與鋅聯(lián)合作用前后，成骨細胞中BMP-2蛋白的表達水平。
　　實驗結果：
　　1、三羥異黃酮單獨作用于MC3T3-E1細胞，其增殖率隨著三羥異黃酮濃度的增加和作用時間的延長而升高，當1×10-5mol/L的三羥異黃酮作用細胞96h時，其增殖率是140.7±21.1％；當Zn濃度為1×10-5mol/L時作用細胞96h，其增殖率最大，為135.9±20.9％；而當1

13、×10-5mol/L的三羥異黃酮協(xié)同1×10-5mol/L的鋅作用細胞96h，其細胞增殖率大于兩者單獨作用，為160.8±20.9％。
　　2、各干預因素處理MC3T3-E1細胞72h后，ALP的活性隨著GS濃度的增加而增強。Gs濃度為1×10-5mol/L時與1×10-5mol/L的Zn單獨作用細胞時，ALP活性分別是對照組的1.5、1.4倍，而當其協(xié)同作用細胞時，ALP活性是對照組的1.7倍。
　　3、GS和Zn作用于M

14、C3T3-E1細胞72h后，細胞中BMP-2蛋白的表達隨著Gs濃度的增加而增強；Gs和Zn協(xié)同作用時BMP-2蛋白的表達比單獨作用時明顯增強。
　　4、三羥異黃酮和鋅聯(lián)合作用后，對MC3T3-E1細胞的增殖、ALP活性的增強、BMP-2表達的增加作用均較各自單獨作用時更為明顯(P<0.05)。
　　實驗結論：
　　三羥異黃酮與鋅協(xié)同作用表現(xiàn)出雌激素效應，可通過促進骨形成蛋白的合成從而促進成骨細胞的增殖、增加骨量。因此，