重組Sj-Ts4樣蛋白在日本血吸蟲病免疫診斷中的初步應用.pdf

1、目的：為了尋找血吸蟲病新的免疫學診斷候選分子，在大腸桿菌中高效表達并純化日本血吸蟲Sj-Ts4樣融合蛋白，建立重組抗原間接ELISA方法(rSj-Ts4-ELISA)診斷日本血吸蟲病。 方法：提取日本血吸蟲成蟲RNA，設計引物，用RT-PCR法擴增出日本血吸蟲sj-Ts4樣蛋白基因編碼基因序列，T載體連接，再將其亞克隆入pGEX-5X-1載體中，經(jīng)酶切、測序證實正確后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α并用IPTG對該重組菌誘導表達，親和層

2、析分離純化得到MW為58KD帶有GST標簽的重組Si-Ts4樣融合蛋白，SDS-PAGE和'Western blot驗證表達量和免疫活性。后換用pET28a(＋)表達載體，誘導表達得到MW為32KD帶有HIS標簽的重組Sj-Ts4樣融合包涵體蛋白，將純化、復性后的rSj-T4樣蛋白和SjAWA包被反應板，確定其最適抗原包被量和血清稀釋度，用rSj-Ts4-ELISA、sjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行檢測34份急性、16份慢

3、性和24份晚期血吸蟲病患者血清；32份其他寄生蟲病患者血清(24份華支睪吸蟲病患者血清，8份鉤蟲病患者血清)以及30份正常對照者血清，比較不同方法之間敏感性，特異性以及交叉反應性。 結果：RT-PCR法擴增出一條大小約為819bp大小的Sj-Ts4樣蛋白的DNA片斷，將其亞克隆表達質(zhì)粒pGEX-5X-1，測序證實具有完整的ORF。誘導表達后，經(jīng)SDS-PAGE可見一條約58KDa大小的GST融合蛋白條帶，親和層析法純化出Sj-

4、Ts4樣蛋白，Western-blot顯示Sj-Ts4樣蛋白能夠與抗GST特異性抗體反應。將目的基因轉(zhuǎn)入表達質(zhì)粒pET28a(＋)，同樣經(jīng)SDS-PAGE可見一條約32KDa大小的HIS融合蛋白條帶。該融合蛋白為包涵體蛋白，經(jīng)變性、純化后，用復性的rSj-Ts4樣蛋白作為抗原做ELISA、與SjAWA-ELISA和SEA-IHA方法平行檢測急、慢性和晚期血吸蟲病患者，華支睪吸蟲病患者、鉤蟲病患者和正常對照者血清，結果顯示：rSj-Ts4

5、-ELISA和SjAWA-ELISA，對于上述34份急性血吸蟲病患者血清檢測的敏感性分別為97.1％和100.0％，經(jīng)校正x2檢驗無顯著性差異(x2=1.02，p>0.05)；16份慢性血吸蟲病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA檢測的敏感性分別為100.0％和100.0％，無差異；24份晚期血吸蟲病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA檢測的敏感性分別為87.5％和75.0％，經(jīng)校正x2檢

6、驗無顯著性差異(x2=1.23，p>0.05)；30份正常人血清，兩種檢測方法的假陽性率分別為6.7％和3.3％，經(jīng)校正x2檢驗也無顯著性差異(x2=0.35，p>0.05)；32份其他寄生蟲病患者血清(華支睪吸蟲病患者血清24份，鉤蟲病患者血清8份)，rSj-Ts4-ELISA和SjAWA-ELISA檢測的血清抗體的陽性率分別為12.5％和25.0％，經(jīng)校正x2檢驗無顯著性差異(x2=1.64，p>0.05)。rSj-Ts4-ELIS

7、A和SEA-IHA，對于34份急性血吸蟲病患者血清檢測的敏感性分別為97.1％和82.4％，經(jīng)校正x2檢驗無顯著性差異(x2=3.98，p>0.05)；16份慢性血吸蟲病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA檢測的敏感性分別為100.0％和68.7％，經(jīng)校正x2檢驗有顯著性差異(x2=5.93，p<0.05)；24份晚期血吸蟲病患者血清，rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA檢測的敏感性分別為87.5％和50.0％，經(jīng)

8、校正x2檢驗有顯著性差異(x2=7.86，p<0.05)；30份正常人血清，兩種檢測方法的假陽性率分別為6.70％和0.00％，經(jīng)校正x2檢驗無顯著性差異(x2=2.07，p>0.05)；32份其他寄生蟲病患者血清(華支睪吸蟲病患者血清24份，鉤蟲病患者血清8份)，rSj-Ts4-ELISA和SEA-IHA檢測的血清抗體的陽性率分別為12.5％和9.4％，經(jīng)校正x2檢驗無顯著性差異(x2=0.10，p>0.05)。在實驗室中rSj-Ts

9、4-ELISA法診斷急、慢性和晚期血吸蟲病，與SjAWA-ELISA法有著相似的敏感性、特異性，與SEA-IHA法相比在檢測慢性和晚期血吸蟲病患者血清中抗體的試驗中重組抗原取得較好的敏感性。且本法操作簡便，易于標準化。本研究rSj-Ts4樣蛋白在診斷中的交叉反應少，表明rSj-Ts4樣蛋白在血吸蟲病免疫診斷上具有較大的應用潛能。 結論：本研究擴增克隆了Sj-TS4樣蛋白基因，在原核細胞中表達并純化了Sj-Ts4樣蛋白，以此rSj