基于調(diào)節(jié)α-SMA、CD133的腦脈通對(duì)I-R老齡大鼠腦微血管生成的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、背景：
　　腦梗死（cerebral infarction）又稱缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke），是各種原因?qū)е履X動(dòng)脈血流中斷，局部腦組織因?yàn)槿毖跞毖l(fā)生壞死，而引起相應(yīng)神經(jīng)功能障礙。腦缺血發(fā)生后如果能及時(shí)在再灌注時(shí)間窗內(nèi)恢復(fù)缺血半暗帶區(qū)的血氧供應(yīng)，可以為神經(jīng)及突觸再生提供營(yíng)養(yǎng)，改善患者的神經(jīng)功能。然而，隨著缺血區(qū)血液供應(yīng)的恢復(fù)，也可能加重組織損傷和功能障礙，即缺血再灌注損傷（Ischemic re

2、perfusion，I/R）。研究表明，在腦缺血再灌注損傷后，可以啟動(dòng)內(nèi)源性血管生成機(jī)制，建立側(cè)枝循環(huán)，適應(yīng)腦組織缺血缺氧損傷，甚至抵御損傷進(jìn)一步加重，并促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)，所以，調(diào)控內(nèi)源性血管生成，重建缺血區(qū)血管網(wǎng)絡(luò)，對(duì)改善腦部供血和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)至關(guān)重要。血管新生即新生的毛細(xì)血管從已存在的血管側(cè)枝中出芽及再塑，是一個(gè)復(fù)雜的生理病理過(guò)程，包括以下幾個(gè)連續(xù)的環(huán)節(jié)[1]：①EC上的生長(zhǎng)因子受體被激活，活化的EC通透性增加，基底膜溶解；②E

3、C增生、遷移并增殖萌芽；③官腔再塑，血管平滑肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等增殖、分化形成成熟的血管腔。EPC是可以直接分化為 EC的前體細(xì)胞，EPC的數(shù)量和功能可以作為反映 EC的標(biāo)志物[2]。本文分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察兩個(gè)部分，首先在前期研究的基礎(chǔ)上，建立腦缺血再灌注模型，在中藥腦脈通的干預(yù)下分別采用α-smooth muscle action(α-SMA)和CD133作為血管平滑肌細(xì)胞（（vascular smooth muscle cel

4、ls，VSMC））和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPS）的標(biāo)記，來(lái)反映大鼠腦缺血后梗死區(qū)的血管新生。同時(shí)對(duì)腦脈通治療老年腦梗死患者的臨床進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，并檢測(cè)老年腦梗死患者外周血CD133的表達(dá)，探索腦脈通對(duì)腦缺血損傷的作用。本課題對(duì)深入研究老年患者缺血性腦卒中的病理生理特點(diǎn)，探索中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的作用途徑和在血管生成方面的影響，具有重要的社會(huì)意義及醫(yī)學(xué)價(jià)值。
　　目的：
　

5、　1.以SD大鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用線栓法制備局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，觀察I/R損傷后青年和老齡大鼠腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d腦血管超微結(jié)構(gòu)變化，并研究腦脈通對(duì)老齡大鼠I/R的保護(hù)作用；
　　2.通過(guò)研究青年模型組、老齡模型組、尼莫地平組、腦脈通組大鼠I3h、I/R24h、I/R3d、I/R6d、I/R12d大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶微血管α-SMA的表達(dá)變化，揭示老齡大鼠I/R腦微血管生成的特點(diǎn)及腦脈通

6、對(duì)其影響；
　　3.通過(guò)研究青年模型組、老齡模型組、尼莫地平組、腦脈通組大鼠I3h、I/R24h、I/R3d、I/R6d、I/R12d缺血區(qū)CD133陽(yáng)性表達(dá)，探索老齡大鼠I/R微血管生成的特點(diǎn)，揭示血管內(nèi)皮祖細(xì)胞與血管再生的關(guān)系及腦脈通對(duì)其影響；
　　4.通過(guò)觀察老年腦梗死患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天NHISS量表評(píng)分及中醫(yī)癥狀量化表評(píng)分，研究腦脈通對(duì)老年腦缺血患者神經(jīng)功能的影響；
　　5.通過(guò)檢測(cè)老年腦

7、梗死患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天外周血CD133陽(yáng)性表達(dá)百分比的變化，研究老年腦梗死患者外周血CD133的表達(dá)變化及腦脈通對(duì)其影響。
　　方法
　　1.采用MCA線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d動(dòng)物模型，通過(guò)電鏡觀察各組大鼠在腦I/R后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織超微結(jié)構(gòu)變化，探討腦脈通對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織病理改變的影響；
　　2.采用MCA線栓法制備大鼠局灶

8、性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12 d動(dòng)物模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠在I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d后大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶微血管α-SMA的表達(dá)變化，研究腦脈通對(duì)老齡大鼠I/R微血管α-SMA表達(dá)變化的影響；
　　3.采用MCA線栓法制備大鼠局灶性腦缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12 d動(dòng)物模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法比較各組大鼠腦缺血3h再灌注1d、3d

9、、6d、12d后大腦皮質(zhì)區(qū)半暗帶CD133表達(dá)變化，研究腦脈通對(duì)老齡大鼠I/R腦組織CD133表達(dá)的影響；
　　4.對(duì)入選的72例缺血性腦卒中患者進(jìn)行臨床觀察，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，分為腦脈通組和對(duì)照組，測(cè)各組患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天NHISS量表評(píng)分及中醫(yī)癥狀量化表評(píng)分，研究腦脈通對(duì)老年腦缺血患者神經(jīng)功能的影響；
　　5.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)入選患者入院當(dāng)天、治療第14天、治療第28天外周血CD133陽(yáng)性標(biāo)記，研

10、究腦脈通對(duì)老年腦梗死患者外周血 CD133表達(dá)的變化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.老齡大鼠腦缺血再灌注后腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化及腦脈通對(duì)其影響
　　青年假手術(shù)組大鼠電鏡觀察結(jié)果示血管基底膜連續(xù)完整，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，胞漿內(nèi)見(jiàn)吞飲小泡；青年模型組可見(jiàn)基膜、線粒體及血管周圍不同程度的水腫，在 I/R1d、 I/R3d程度最重，I/R6d、I/R12d逐漸減輕；老年假手術(shù)組微血管周圍無(wú)明顯水腫，線粒體結(jié)構(gòu)基

11、本完整，吞咽小泡減少；老齡模型組可見(jiàn)血管周圍、細(xì)胞質(zhì)及線粒體水腫，尤以I/R3d最重；尼莫地平組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體水腫，尤以I/R12d最重；腦脈通組可見(jiàn)管周圍輕度水腫，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體水腫，在I/R12d明顯減輕。
　　2.老齡大鼠腦I/Rα-SMA蛋白表達(dá)時(shí)程變化及腦脈通對(duì)其表達(dá)的影響
　　由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青、老年假手術(shù)組均可見(jiàn)α-SMA少量陽(yáng)性表達(dá)；青年模型組I/R1d時(shí)陽(yáng)性表達(dá)開(kāi)始上升，I/R6d、I/R12d維持在較高水

12、平；與青年模型組相比較，老齡模型組I3h、I/R1d、I/R3d、I/R12d表達(dá)均低于青年模型組（P<0.05，P<0.01）；與老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)比較，腦脈通組和尼莫地平組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)都高于老齡模型組（P<0.05）。
　　3.老齡大鼠腦I/R CD133蛋白表達(dá)時(shí)程變化及腦脈通對(duì)其表達(dá)的影響
　　由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青、老年假手術(shù)組均可見(jiàn)CD133少量陽(yáng)性表達(dá)，在I/R1d時(shí)陽(yáng)性表達(dá)開(kāi)始上升，I/R6d最高，I/R

13、12d開(kāi)始下降；與青年模型組比較，老齡模型組相同時(shí)間點(diǎn)CD133的表達(dá)較低，在I/R3d、I/R6d時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；與老齡模型組同時(shí)間點(diǎn)相比，尼莫地平及腦脈通組大鼠腦組織 CD133陽(yáng)性表達(dá)水平均增高（P<0.05，P<0.01）；與尼莫地平組同時(shí)間相比，腦脈通組I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d大鼠腦組織CD133陽(yáng)性表達(dá)水平增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.腦脈通對(duì)腦梗死患者

14、NHISS量表評(píng)分及中醫(yī)癥狀分級(jí)量表變化的影響
　　經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較，治療14天、治療28天腦脈通組NHISS量表評(píng)分低于對(duì)照組（P<0.05.）；與對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較，治療14天、治療28天腦脈通組中醫(yī)癥狀分級(jí)量表評(píng)分低于對(duì)照組（P<0.05.）。
　　5.腦脈通對(duì)老年腦梗死患者外周血CD133的表達(dá)時(shí)程變化的影響
　　經(jīng)流失細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：老年腦梗死患者14d外周血CD133表達(dá)最多，并且腦

15、脈通組高于對(duì)照組（P<0.01），28dCD133表達(dá)較14天降低（P<0.01），仍高于入院當(dāng)天（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.在遭受相同條件的I/R損傷時(shí)，與青年模型組相比，老齡模型組相應(yīng)時(shí)間的大鼠損傷出現(xiàn)較早，損傷較重，恢復(fù)慢；與老齡模型組相比，腦脈通組和尼莫地平組腦組織病理?yè)p傷程度較輕，尤以腦脈通組大鼠腦組織損傷程度最輕，修復(fù)最快，提示腦脈通可明顯改善老齡大鼠腦I/R后組織的損傷，并促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)；

16、　　2.老齡大鼠腦I/R損傷后，腦組織內(nèi)可見(jiàn)微血管生成標(biāo)記物α-SMA蛋白的表達(dá)，且隨腦 I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增多；與老齡模型組相比，腦脈通組和尼莫地平組相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)α-SMA蛋白的表達(dá)水平增高，尤以腦脈通組顯著，提示腦脈通促進(jìn)老齡大鼠腦I/R后微血管生成；
　　3.老齡大鼠腦I/R損傷后，腦組織內(nèi)可見(jiàn)微血管生成標(biāo)記物CD133蛋白的表達(dá)，且隨腦I/R時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增多，I/R12d時(shí)開(kāi)始下降；與老齡模型組相比，腦脈通

17、組和尼莫地平組相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn) CD133蛋白的表達(dá)水平增高，尤以腦脈通組顯著，提示腦脈通促進(jìn)老齡大鼠腦 I/R后微血管生成；
　　4.老年腦缺血患者在發(fā)病急性期NHISS量表評(píng)分及中醫(yī)癥狀分級(jí)量化表評(píng)分最高，隨著腦缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，評(píng)分逐漸降低，腦脈通組比較明顯，提示腦脈通可以改善老年腦缺血患者神經(jīng)功能；
　　5.老年腦缺血患者在發(fā)病急性期外周血可見(jiàn)CD133表達(dá)，在治療14天陽(yáng)性表達(dá)最高，治療28天有所下降，腦脈通組比較明顯，