Oct4、Sox2、C-Mye、Klf4-腺病毒載體的構(gòu)建與包裝及感染小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)是選用某些特異的轉(zhuǎn)錄因子，將體細(xì)胞重編程為具有多能性的干細(xì)胞。由多種體細(xì)胞建立的iPSCs，如今已成為生命科學(xué)領(lǐng)域不可或缺的研究素材，其擁廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)為提高iPSCs建系效率、降低誘導(dǎo)成本、把握質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn)為參考條件，以促進(jìn)其在臨床應(yīng)用中的發(fā)展。在分化的成體細(xì)胞表達(dá)的目的轉(zhuǎn)錄因子-Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc，并將其

2、體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，這一革命性的研究策略很快吸引了公眾和科學(xué)界的注意，是因?yàn)榇思夹g(shù)很好的避免了干細(xì)胞應(yīng)用中的倫理道德約束和免疫排斥問(wèn)題。病人特異的iPSCs的應(yīng)用為遺傳性疾病和退行性疾病的臨床治療帶來(lái)了新的希望。
　　目的:(1)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四個(gè)目的基因的質(zhì)粒，并通過(guò)質(zhì)粒的提取和純化成功包裝能同時(shí)表達(dá)這4種轉(zhuǎn)錄因子的腺病毒(Adenovirus vector)，并通過(guò)目的基因過(guò)

3、表達(dá)腺病毒顆粒感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblasts MEF），目的在于探討誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞成功誘導(dǎo)提供方法。
　　方法:(1)從攜帶Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4的四個(gè)質(zhì)粒中獲取目的基因，然后將酶切線性化后的腺病毒載體與目的基因進(jìn)行精準(zhǔn)連接，利用酶切及PCR方法測(cè)定病毒載體的正確性，對(duì)培養(yǎng)出的陽(yáng)性克隆予以序列檢測(cè)，序列正確且一致表明成功構(gòu)建質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取和純化，觀察病毒感

4、染HEK293細(xì)胞二十四小時(shí)后的表達(dá)情況，測(cè)定病毒的功能及滴度。(2)用胰蛋白酶消化法在體外培養(yǎng)分離MEF，對(duì)MEF細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察，用不同胎齡的小鼠，不同濃度胰蛋白酶作用時(shí)間對(duì)MEF培養(yǎng)的影響進(jìn)行觀察對(duì)比研究;(3)利用腺病毒空病毒顆粒感染MEF，并以不同MOI值腺病毒分別感染MEF，并得出感染最佳值。(4)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MEF細(xì)胞隨機(jī)分成a、b、c三組，用攜帶目的基因的腺病毒感染a組、空病毒顆粒腺病毒感染b組、無(wú)病毒感染的c

5、組，在倒置顯微鏡下觀察期形態(tài)變化，最終得出最佳的實(shí)驗(yàn)條件。
　　結(jié)果:(1)載體酶切線性化后成功與目的基因PCR酶切產(chǎn)物對(duì)接，其陽(yáng)性克隆產(chǎn)物鑒定后證實(shí)腺病毒載建立成功，且測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列一致，腺病毒滴度為1×1010PFU/ml;(2)采用胰蛋白酶分次消化法培養(yǎng)MEF，13.5d胎齡鼠胚的MEF分離培養(yǎng)為最佳，MEF培養(yǎng)24小時(shí)后大部分貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞傳代至第三代較為旺盛。(3)摸索出腺病毒感染MEF的最佳區(qū)間為20-100，將攜