NF-κB信號(hào)通路在炎癥狀態(tài)下人牙周膜干細(xì)胞成骨分化中的調(diào)控作用.pdf

1、牙周病是造成成年人缺牙的首要原因,發(fā)病率高達(dá)90％。其發(fā)病機(jī)制是由于細(xì)菌聚集于牙表面或侵入牙周組織,通過(guò)直接侵襲及引發(fā)機(jī)體慢性炎癥反應(yīng),引起牙周軟組織連接的破壞及牙槽骨的吸收,造成牙支持結(jié)構(gòu)的喪失,最終導(dǎo)致牙松動(dòng)脫落。目前尚沒(méi)有有效根治牙周病的手段和方法。
　　正常情況下,牙周組織具備良好的再生能力,牙槽骨與牙周膜始終處于動(dòng)態(tài)改建過(guò)程中,維持著牙周支持結(jié)構(gòu)的完整性。牙周膜中有一群多潛能成體干細(xì)胞,表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物,具備

2、自我更新及多向分化能力,體外誘導(dǎo)能夠形成骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、血管等多種組織,并能在體內(nèi)移植后形成牙骨質(zhì)-牙周膜-牙槽骨樣結(jié)構(gòu)物,被認(rèn)為在牙周改建、再生、修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)牙周局部炎癥微環(huán)境可以通過(guò)抑制 PDLSCs的再生能力導(dǎo)致牙周組織的破壞,但其具體機(jī)制尚不清楚。
　　NF-κB是免疫轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。各種急性及慢性炎癥均能導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路活化,并通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活下游免疫相關(guān)基因而發(fā)揮重要作用。

3、同時(shí),NF-κB信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控 RANKL/RANK表達(dá)、調(diào)節(jié)成骨分化信號(hào)通路及骨基質(zhì)形成,而對(duì)骨發(fā)育和骨改建過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。但以往研究大多關(guān)注于炎癥因子活化NF-κB信號(hào)通路對(duì)破骨細(xì)胞形成及活化的作用,對(duì)于其是否參與了牙周病慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,是否導(dǎo)致了牙周病骨形成缺陷,是否對(duì) PDLSCs的成骨分化具有抑制作用,及其具體的信號(hào)調(diào)控途徑及機(jī)制尚不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)利用從健康人群和牙周病患者牙周組織中分離純化的牙周膜干細(xì)胞,

4、比較NF-κB信號(hào)通路在不同來(lái)源干細(xì)胞中的表達(dá)差異,研究其在炎癥條件下對(duì) PDLSCs成骨分化的作用機(jī)制,從而加深對(duì)牙周病發(fā)病機(jī)制的了解,并為尋找特異性的治療靶點(diǎn)、探索基于干細(xì)胞的再生手段提供新的思路。
　　研究目的:
　　1)探討牙周組織局部慢性炎癥微環(huán)境對(duì)人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)生物學(xué)特性的影響。
　　2)探

5、討炎癥微環(huán)境對(duì)hPDLSCs內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的影響,及NF-κB信號(hào)通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用。
　　3)探討炎癥微環(huán)境是否通過(guò)NF-κB通路抑制了hPDLSCs的成骨分化;調(diào)控 NF-κB通路中關(guān)鍵分子能否逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境對(duì)于牙周膜干細(xì)胞成骨分化的抑制。
　　研究方法:
　　1)利用組織消化、有限稀釋法獲取正常和慢性牙周炎癥來(lái)源的hPDLSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)

6、志分子的表達(dá),MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期檢測(cè)比較兩種干細(xì)胞的增殖能力,成骨和成脂分化誘導(dǎo)檢測(cè)兩種干細(xì)胞的多向分化能力。
　　2)利用Western Blot檢測(cè)p65、IκBα和p-IκBα在不同來(lái)源牙周膜干細(xì)胞及其成骨分化過(guò)程中的表達(dá)差異。通過(guò)利用BAY11-7082抑制NF-κB通路后茜素紅染色、成骨關(guān)鍵基因和蛋白的檢測(cè)比較 NF-κB信號(hào)通路在hPDLSCs成骨過(guò)程中的調(diào)控作用。
　　3)利用TNF-α(10ng/

7、mL)模擬牙周炎癥微環(huán)境,激活NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)行獲得性功能驗(yàn)證;利用BAY11-7082抑制NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)行缺失性功能研究。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1)分離培養(yǎng)的兩種牙周膜干細(xì)胞均表現(xiàn)為間充質(zhì)細(xì)胞特性。體外有限稀釋法單細(xì)胞培養(yǎng)均出現(xiàn)細(xì)胞克隆,表現(xiàn)出自我更新能力;炎癥組的克隆形成率高于正常組;MTT和細(xì)胞周期均顯示炎癥來(lái)源干細(xì)胞的增值能力明顯高于對(duì)照組;成骨、成脂誘導(dǎo)后實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明炎癥來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞的分化能力不

8、如正常牙周膜干細(xì)胞。
　　2)炎癥組織來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中,IκBα磷酸化上調(diào)表達(dá)較正常組織來(lái)源細(xì)胞明顯,核內(nèi)p65表達(dá)也增高。而在加入BAY11-7082后,能部分恢復(fù)炎癥組織來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞的成骨能力。
　　3)炎癥因子 TNF-α刺激正常組織來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞后,NF-κB信號(hào)通路明顯激活,成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)明顯下調(diào),說(shuō)明hPDLSCs的成骨能力收到了抑制。在TNF-α刺激的同時(shí)加入BAY11-708

9、2后,成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)上調(diào),說(shuō)明抑制 NF-κB通路能部分恢復(fù) TNF-α所致的牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力的降低。
　　結(jié)論:
　　1.牙周慢性炎癥環(huán)境影響了牙周膜內(nèi)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　2.炎癥牙周膜干細(xì)胞中 NF-κB信號(hào)通路的活化抑制了 P-PDLSCs的成骨分化能力,BAY11-7082阻斷NF-κB信號(hào)通路后,能部分恢復(fù)其成骨能力。
　　3.炎癥因子TNF-α能明顯激活NF-κB信號(hào)通路,并