杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良高危家族的產(chǎn)前基因檢測(cè).pdf_第1頁(yè)
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1、目的: 杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DuehenneMuscularDystrophyDMD)是兒童最常見的X連鎖隱性遺傳致死性神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病,約為活產(chǎn)男嬰的1/3500,進(jìn)行性肌萎縮和肌無(wú)力,伴腓腸肌假性肥大是其典型的臨床特征,血清肌酸磷酸激酶(CPK)明顯升高,肌活檢顯示營(yíng)養(yǎng)不良性肌病型,預(yù)后極差?;颊咂骄?~6歲發(fā)病,7~10歲左右即無(wú)法行走,多于20歲左右因心肺合并癥而死亡,嚴(yán)重影響了青少年男性的健康成長(zhǎng)。本病目前尚無(wú)有效的治療

2、方法。DMD患者1/3是新生突變,2/3由遺傳而來(lái),因此產(chǎn)前基因檢測(cè)是降低DMD患者出生及提供遺傳咨詢的重要措施,對(duì)提高人口質(zhì)量具有十分重要的意義。 致病基因dystrophin基因定位于Xp21.1-21.3,全長(zhǎng)約為2400kb,是目前已知的人類最大的基因之一,約占整個(gè)X染色體長(zhǎng)度的1%及整個(gè)基因組長(zhǎng)度的0.1%,其中79個(gè)外顯子編碼序列總長(zhǎng)度僅為14kb,78個(gè)內(nèi)含子為該基因的大部分序列。內(nèi)含子區(qū)具有易脆性,致病基因的斷裂

3、點(diǎn)常非隨機(jī)地發(fā)生于內(nèi)含子區(qū),有92%的缺失斷裂點(diǎn)發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域,內(nèi)含子序列在不同地域及民族中存在顯著性差異。Dystrophin基因突變類型以缺失最為常見,約占55~65%,主要分布5'端和中央兩個(gè)缺失熱點(diǎn)區(qū);基因重復(fù)約占5~10%,其余的突變?yōu)辄c(diǎn)突變或微缺失,通常導(dǎo)致無(wú)義突變和移碼突變。 本研究在確定胎兒性別后,首先利用dystrophin基因內(nèi)常見18對(duì)外顯子引物的mPCR方法,檢測(cè)了缺失型DMD患者,并對(duì)其家族胎兒進(jìn)行相

4、應(yīng)缺失位點(diǎn)的檢測(cè),然后應(yīng)用dystrophin基因內(nèi)含子區(qū)的5對(duì)(CA)n引物,采用STR-PCR方法對(duì)非缺失型家族成員進(jìn)行基因檢測(cè)及產(chǎn)前基因檢測(cè)。并且對(duì)mPCR引物進(jìn)行優(yōu)化組合。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)便、可靠、臨床實(shí)用性較強(qiáng)的DMD高危家族的基因檢測(cè)及其產(chǎn)前基因檢測(cè)方法,為臨床:DMD高危家族孕婦開展了遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷奠定了一定基礎(chǔ)。 材料與方法: 材料: 1.收集臨床病例:收集4例DMD患者均具有典型的臨

5、床表現(xiàn),結(jié)合肌電圖、血清心肌酶譜及部分肌肉活檢而臨床確診; 2.樣本來(lái)源:抽取每名受檢者外周靜脈血5ml;在3例DMD高危家族的產(chǎn)前基因診斷中,于孕中期取羊水20ml,孕后期采臍血為樣本2ml,提取樣本DNA。 3.引物合成:1對(duì)性別決定基因(SYR)引物,dystrophin基因的18對(duì)外顯子引物和5對(duì)(CA)n引物均在NCBI上采用BLAST工具做比對(duì),確定了所有引物準(zhǔn)確性。 方法:先用SRY引物進(jìn)行PCR擴(kuò)

6、增判斷胎兒性別,而后采用mPCR方法檢測(cè)DMD患者:如檢測(cè)出有外顯子缺失的患者,再用單管PCR檢測(cè)胎兒相應(yīng)位點(diǎn),檢測(cè)男性胎兒是否缺失。對(duì)女性胎兒或未檢出外顯子缺失的男性胎兒,則采用STR-PCR擴(kuò)增進(jìn)行家系連鎖分析,以檢測(cè)胎兒的風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)行DMD的產(chǎn)前基因診斷。 建立穩(wěn)定PCR反應(yīng)體系: 1.SYR引物的PCR反應(yīng)體系:總體積25ul,含有基因組DNA50ng,dNTP各200umol/L,引物各0.2umol/L,1xB

7、ueffr,Tarq酶用量2u。 2.mPCR反應(yīng)體系:總體積15ul,含有基因組DNA100ng,dNTP各200umol/L,引物各0.2umol/L,1xBueffr,Tarq酶用量3u,引物分四組:A、B、C、D組。 3.STR-PCR反應(yīng)體系:總體積25ul,含有基因組DNA50ng,dNTP各200umol/L,引物各0.2umol/L,1xBueffr,Tarq酶用量2U。 性別決定基因(SRY)引

8、物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳,18對(duì)外顯子引物的mPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳,(CA)n引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,均采用SYRBGreen熒光染料,自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。 結(jié)果: 胎兒性別決定基因檢測(cè),共檢出4例胎兒,其中2例單胎和1例雙胎之甲胎為男性,1例雙胎之乙胎為女性,胎兒性別基因檢測(cè)結(jié)果均完全與胎兒羊水細(xì)胞的核型分析相符,且與胎兒出生后性別完全相同。采用mPCR結(jié)

9、合STR-PCR方法對(duì)4例DMD患者的高危家族進(jìn)行產(chǎn)前基因突變類型檢測(cè)結(jié)果表明:4例DMD患者中有2例檢測(cè)出dystrophin基因外顯子的缺失,1例DMD患者為50,51二個(gè)外顯子缺失,另1例雙胎孕婦高危家族中DMD患者檢測(cè)出43外顯子缺失,同時(shí)對(duì)雙胎之男胎進(jìn)行dystrophin基因43外顯子檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)男胎有43外顯子缺失。2例缺失型DMD患者的外顯子缺失位點(diǎn)主要集中在中央缺失熱區(qū)(44~52)內(nèi),這與以往的研究較為一致。另2例D

10、MD患者的18對(duì)外顯子引物的mPCR未檢測(cè)到dystrophin基因外顯子的缺失,為非缺失型DMD患者。對(duì)3例DMD高危家族(包括2例非缺失型DMD高危家族和1例缺失型DMD雙胎高危家族)進(jìn)行STR-PCR的dystrophin基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn):3例DMD高危家族的4例胎兒均繼承了與患者相同的母源致病單體型,除1例雙胎之女胎為風(fēng)險(xiǎn)基因攜帶者外,其余3例男胎均為DMD高危胎兒,3例患者母親均為雜合型,同時(shí)3例家族的其它成員均未檢測(cè)dystro

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