高遷移率族蛋白B1與晚期糖基化終產物受體對前列腺癌PC-3細胞生物學行為的影響.pdf

1、前列腺癌是歐美國家男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在美國其死亡率僅次于肺癌居第二位。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，美國2015年前列腺癌發(fā)病患者將達到220800人，占男性所有惡性腫瘤的26％，其死亡人數(shù)較前雖有輕微下降，但仍將達到27540人。我國前列腺癌的發(fā)病率雖低于西方國家，但由于生活方式西化、人口老齡化及前列腺特異抗原(PSA)篩查的普及，近10年來前列腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達國家更為迅速。
　　由于前列腺癌

2、早期發(fā)病隱匿，患者確診時不少已有遠處轉移，因而失去了根治性治療的最佳時機。隨著直腸指診（DRE）聯(lián)合PSA應用篩查的普及，前列腺癌早期診斷率有了顯著的提高。但是PSA的敏感性和特異性皆存在一定的局限性，致使其在臨床應用上仍存在一些爭議。當以血清PSA＞10ng/ml為參考值時，臨床漏診率為25％;當PSA值位于臨床診斷灰區(qū)的4～10ng/ml時，僅有30％的患者被診斷為前列腺癌。治療上，根治性治療（根治性前列腺切除術、外放射治療）是目前

3、局限性前列腺癌最有效的治療方法，但部分根治性治療的早期前列腺癌患者仍有復發(fā)的可能。轉移性前列腺癌的治療目前主要依靠內分泌治療，但是往往因逐漸對激素非依賴而發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），使治療變得更加困難。由此，當前需要迫切尋找新的特異性和敏感性均較高的前列腺癌標志物以及潛在的治療新靶點，盡可能做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預、早治療，并且進一步提高療效，這是當前前列腺癌研究的重要課題。
　　但前列腺癌發(fā)生發(fā)和進展的分子機制至今仍

4、不清楚。以往的研究表明，前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與染色體畸形、野生型p53、p16、PTEN、mn23、NKX3.1、Rb等抑癌基因的失活，c-myc、c-met、ras等癌基因的異常表達，AR、PSA、VDR等基因多態(tài)性及TMPRSS2-ERG基因融合等過程有關。而近年的研究表明，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）及其主要受體晚期糖基化終產物受體(RAGE)也與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　HMGB1是高遷移率族蛋白B（HMGB）家

5、族成員，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳時的快速遷移而得名。HMGB1早期命名為兩性素（amphoterin），是一種存在于真核生物細胞內的非組蛋白染色體結合蛋白。細胞核內的HMGB1參與穩(wěn)定核小體結構、DNA重組和修復、調節(jié)基因轉錄及類固醇激素調控等生命活動。胞內HMGB1還可以由炎癥細胞主動分泌或者壞死細胞被動分泌進入胞外。胞外的HMGB1同時是損傷相關分子模式（DAMP）分子，參與許多腫瘤相關炎癥的發(fā)生。它能作為一種信號分子，由細胞核內的分

6、泌到細胞外，在免疫、炎癥、自噬、細胞分化、細胞遷移及腫瘤增殖轉移等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。胞外HMGB1的受體包括RAGE、Toll樣受體家族(Toll-like receptor，TLR)、CD24、IL-1R、髓系細胞觸發(fā)受體1(TREM-1)等。細胞外的HMGB1可以通過與其受體結合，主要是通過與RAGE結合，廣泛地參與了腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤及轉移等過程。
　　RAGE最早是Neeper等從牛肺中獲得的。它是一種單跨膜

7、蛋白，屬于免疫球蛋白超家族跨膜受體。人RAGE編碼基因位于Ⅲ類主要組織相容性復合物（MHCⅢ）區(qū)域。人RAGE由404個氨基酸組成，位于細胞膜上，由胞外段、跨膜段和胞內段組成。RAGE在人體生理情況下呈低水平表達（除成熟Ⅰ型肺泡細胞和胚胎細胞外），而在糖尿病、自身免疫病、神經變性疾病、血管疾病及腫瘤等疾病中表達顯著增高。RAGE作為信號轉導受體介導其配體結合在單核巨噬細胞、血管內皮細胞、腎系膜細胞、神經細胞、血管平滑肌細胞及多種腫瘤細胞

8、表面，激活細胞內部各種信號轉導機制，發(fā)生病理效應。RAGE雖然是由于與晚期糖基化終產物(AGE)相互作用被發(fā)現(xiàn)并因此得名，但其配體除AGE之外，還包括HMGB1，β-淀粉樣多肽（amyloid-β peptide），S100蛋白等，這些配體分別與RAGE相互作用，激活相應的信號轉導途徑，產生不同的生物學效應，在各種疾病中扮演著不同的角色。
　　近些年來，HMGB1與RAGE對腫瘤的作用越來越受到人們的關注。目前已發(fā)現(xiàn)HMGB1/R

9、AGE軸與包括結直腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、惡性間皮瘤等惡性腫瘤密切相關。研究認為，HMGB1及其受體RAGE可調控這些腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，而阻斷RAGE與其配體HMGB1的相互作用，能夠抑制腫瘤的生長及轉移。HMGB1/RAGE軸與前列腺癌的作用關系是近年才被發(fā)現(xiàn)的。2003年，Kuniyasu等對40名術前經促性腺激素釋放激素(LHRH)抑制劑去勢治療的pT3期前列腺癌患者的術后標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞及間

10、質細胞中的RAGE和HMGB1呈高表達，在有轉移的患者中更明顯;進一步的細胞學實驗還發(fā)現(xiàn)在阻斷雄激素后，HMGB1/RAGE系統(tǒng)可通過旁分泌途徑促進腫瘤細胞與間質細胞的相互作用，從而促進前列腺癌的發(fā)展和轉移。2005年Ishiguro等研究發(fā)現(xiàn)HMGB1和RAGE在未經治療的前列腺癌組織和激素難治性前列腺癌組織中的mRNA水平表達較正常前列腺組織明顯增高。在3種前列腺癌細胞株(DU145，PC-3和LNCaP細胞)中，發(fā)現(xiàn)在DU145即

11、激素非依賴性前列腺癌細胞株中，RAGE表達最高。HMGB1在上述3個細胞株中均有表達。2012年Elangovan等通過體外動物實驗和體內細胞實驗發(fā)現(xiàn)通過特異性阻斷HMGB1/RAGE軸能抑制前列腺腫瘤生長。
　　在我們前期的工作中，我們通過免疫組化證實在組織水平，HMGB1和RAGE在前列腺癌組織中存在高表達，HMGB1和RAGE蛋白的表達以及兩者的共表達與前列腺癌的浸潤深度、局部淋巴結的轉移以及遠處轉移密切相關，進一步對隨訪資

12、料進行Kaplan-Meier生存分析后發(fā)現(xiàn)， HMGB1和RAGE的共表達與晚期前列腺癌患者的預后呈負相關關系。
　　目的：
　　HMGB1和RAGE在前列腺癌中是否存在相互作用，及其相互作用對前列腺癌生物學行為（增殖、遷移、凋亡等）有何影響及可能存在的作用機制。在細胞水平進一步探索及驗證。這將為HMGB1和RAGE對前列腺癌診斷、治療和評估的意義提供實驗依據(jù)，為前列腺癌的臨床診治提供新的思路和方法。
　　方法：

13、r>　　基于以上認識，本研究首先進行用Western Blot檢測3種前列腺癌細胞系及前列腺增生細胞系中HMGB1蛋白的表達情況;利用免疫熒光技術觀察HMGB1在前列腺癌細胞系和前列腺增生細胞系的定位情況;利用瓊脂糖親和柱(Ni-IDA)純化獲得外源性HMGB1蛋白;接著利用CCK-8檢測外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3細胞的增殖情況;然后用細胞劃痕實驗觀察外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3細胞的遷移情況;再利用Annexin

14、-V-FITC凋亡試劑盒檢測外源性HMGB1對PC-3凋亡能力的影響。利用免疫熒光觀察HMGB1質粒的轉染效率，進一步用Western Blot驗證HMGB1過表達模型;接著分別利用CCK-8檢測、細胞劃痕實驗、凋亡試劑盒檢測過表達HMGB1下對前列腺癌PC-3細胞的增殖、遷移情況、凋亡能力的影響。利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術干擾前列腺癌PC-3細胞RAGE的表達;在沉默RAGE情況下，分別用CCK-

15、8檢測、細胞劃痕實驗、凋亡試劑盒檢測外源性HMGB1對PC-3增殖、遷移和凋亡能力的影響，以觀察HMGB1與RAGE在前列腺癌細胞中的相互作用。
　　結果：
　　1.前列腺癌細胞高表達HMGB1;HMGB1在前列腺增生細胞系和前列腺癌細胞系主要表達于細胞核內，在細胞質中也有表達。
　　2.成功純化得到His-HMGB1融合蛋白。
　　3.外源性HMGB1呈濃度依賴性及時間依賴性促進前列腺癌PC-3細胞增殖;外源性

16、HMGB1刺激前列腺癌細胞可促進其遷移能力;外源性HMGB1刺激前列腺癌細胞可促進其抗凋亡能力。
　　4.觀察HMGB1質粒在前列腺癌PC-3細胞的轉染效率，并成功構建過表達HMGB1的前列腺癌細胞模型。
　　5.過表達HMGB1蛋白可促進前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移和抗凋亡能力。
　　6.利用RNAi技術成功沉默前列腺癌PC-3細胞RAGE蛋白的表達。
　　7.沉默RAGE后，HMGB1促進前列腺癌PC-3細