慢病毒介導(dǎo)BMPs基因促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:
　　 骨再生是治療骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而大塊骨缺損的修復(fù)是骨科醫(yī)生最常遇見(jiàn)的臨床問(wèn)題。組織工程骨有望解決植骨后新骨形成緩慢的問(wèn)題，近年來(lái)，組織工程技術(shù)的發(fā)展日趨成熟，使得骨缺損的修復(fù)成為可能，其中如何促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖和成骨分化成為組織工程技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和研究熱點(diǎn)。理想的組織工程化骨必須具備以下三個(gè)要素:種子細(xì)胞、細(xì)胞因子和支架材料。在促進(jìn)骨形成的眾多調(diào)節(jié)因子中，骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎發(fā)育及骨骼形

2、成中扮演重要的角色。目前發(fā)現(xiàn)的BMP家族成員骨誘導(dǎo)活性中研究較多的有BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9等。目的:針對(duì)小鼠BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建第三代自體失活BMPs慢病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，構(gòu)建成骨誘導(dǎo)因子基因修飾的小鼠類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察感染后細(xì)胞各基因和蛋白的干擾效率;觀察感染后細(xì)胞體外成骨分化的影響;評(píng)價(jià)各成骨誘導(dǎo)因子的成骨分化能力。

3、>　　 方法:
　　 以cDNA文庫(kù)為模版，應(yīng)用PCR方法獲得BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9，基因的編碼序列，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后抽取質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)質(zhì)粒載體，酶切鑒定重組體并且經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步確定。然后用pLP/VSVG，pLP2，pLP1質(zhì)粒與BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。包裝pELNS-BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9后轉(zhuǎn)染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MC3T3-E

4、1細(xì)胞，GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染效果。茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)，Western-Blot和Real time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)(Runx2)的表達(dá)水平，鑒定各成骨誘導(dǎo)因子的單獨(dú)轉(zhuǎn)染效能。最后用雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染（共7組）MC3T3-E1細(xì)胞，GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染效果;應(yīng)用ELISA檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)上清中BGP和ALP的表達(dá)水平;應(yīng)用Real time PCR檢測(cè)Runx2 mRNA的表達(dá)水平;應(yīng)用Western blot檢測(cè)BM

5、P2，BMP4，BMP6，BMP7，BMP9蛋白的表達(dá)水平，鑒定雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染的成骨分化效能。
　　 結(jié)果:
　　 pELNS-BMP2, pELNS-BMP4, pELNS-BMP6, pELNS-BMP7, pELNS-BMP9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組慢病毒pELNS-BMP2，pELNS-BMP4，pELNS-BMP6，pELNS-BMP7，pELNS-BMP9構(gòu)建成功，成功轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞;Runx2表達(dá)水

6、平:BMP2＞BMP4＞BMP9＞BMP7＞BMP6;茜素紅染色顯示BMP-2鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最多。雙基因（共8組）聯(lián)合轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，GFP熒光證實(shí)轉(zhuǎn)染成功;Runx2 mRNA表達(dá)水平:T5＞T3＞T1＞T2＞T6＞T4＞T7;BGP表達(dá):T5＞T3＞T4＞T6＞T2＞T1＞T7;ALP表達(dá):T5＞T3＞T1＞T2＞T4＞T6＞T7;結(jié)果顯示，T5(BMP2，BMP7)共轉(zhuǎn)染成骨效率最高，Western blot證實(shí)BMP2和B