CXCR4抑制劑AMD3100對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、SDF-1（stromal-derived factor-1，間質(zhì)衍生因子），也被稱為CXCL12，通過激活G蛋白偶聯(lián)受體-CXCR4（C-X-C chemokine receptor4，C-X-C型趨化因子受體4），在調(diào)節(jié)干細(xì)胞／前體細(xì)胞及淋巴細(xì)胞運輸、炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)的維持、紅細(xì)胞生成、心臟及血管等器官發(fā)生以及組織器官再生等過程中起著重要作用。
　　 AMD3100是一種人工合成的小分子大環(huán)類SDF-1受體CXCR4特異性

2、拮抗劑，可有效地與CXCR4結(jié)合，阻斷SDF-1與CXCR4之間的結(jié)合以及隨后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可作為治療非何杰金氏淋巴瘤(NML)及多發(fā)性骨髓瘤(NM)的一種有效的造血干細(xì)胞動員劑。研究表明，AMD3100在SDF-1/CXCR4信號通路參與調(diào)控的病理過程中發(fā)揮重要作用。
　　 最近研究表明，SDF-1/CXCR4信號通路在骨生長分化及重塑、鈣動員、骨髓成髓作用以及成骨細(xì)胞分化過程中起作用，Kitaori等人研究表明SDF-1/CX

3、CR4信號通路在體內(nèi)骨骼修復(fù)過程中參與骨折部位間充質(zhì)干細(xì)胞( mesenchymal stem cells，MSCs)的募集；Zhu及Hosogane等人研究表明該通路參與骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP2）介導(dǎo)的初級MSC或MSC細(xì)胞系的成骨分化過程。并且，在多種干細(xì)胞以及前體細(xì)胞中均有SDF-1和CXCR4的表達(dá)，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中二者表達(dá)尤為豐富，一旦細(xì)胞開始分化二者表達(dá)量會顯著下降

4、，Kortesidis A等在體外實驗中發(fā)現(xiàn)SDF-1和CXCR4在前成骨細(xì)胞中高度表達(dá)，而在成熟的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞中含量較低，這表明SDF-1/CXCR4信號通路在成骨分化前期起著重要作用。因此，成骨分化過程中SDF-1/CXCR4信號通路拮抗劑AMD3100的有效性及毒性研究顯得尤為必要。到目前為止，有關(guān)AMD3100在MSC細(xì)胞成骨分化初期發(fā)揮作用的研究甚少，尤其是AMD3100對前成骨細(xì)胞基質(zhì)礦化調(diào)節(jié)的研究尚未見文獻(xiàn)報道。

5、r>　　 另外，SDF-1與CXCR4的結(jié)合會激活JAK/STAT通路，JAK（Janus kinase，Janus激酶）被CXCR4激活并與之結(jié)合，該結(jié)合可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子STAT3（signaltransducer and activator of transcription3，信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3）的募集和酪氨酸磷酸化，而AMD3100可能通過調(diào)節(jié)STAT3而在前成骨細(xì)胞的成骨分化過程中發(fā)揮一定的作用。
　　 目的:

6、r>　　 本研究旨在闡釋SDF-1/CXCR4通路在成骨分化過程中的具體作用機(jī)制，便于更深入、系統(tǒng)地研究和了解成骨分化復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)。采用CXCR4拮抗劑AMD3100抑制SDF-1和CXCR4的結(jié)合，為進(jìn)一步研究細(xì)胞成骨分化調(diào)控過程中SDF-1/CXCR4信號通路抑制劑的作用機(jī)制提供新思路。
　　 方法:
　　 本研究擬采用小鼠顱頂前骨細(xì)胞系——MC3T3-E1亞克隆14，觀察CXCR4拮抗劑AMD3100對地塞

7、米松(dexamethasone，DEX)、抗壞血酸(L-ascorbic acid, AA)和β-磷酸甘油(β-glycerophosphate，β-GP)誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。本研究擬采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測的方法檢測礦化前后ALP活性變化，采用茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，并應(yīng)用熒光定量PCR的方法檢測礦化標(biāo)志蛋白ALP、Runx2/cbfal、ANK、OCN

8、等基因的表達(dá)，以及采用Western Blot的方法檢測SDF-1/CXCR4通路下游蛋白STAT3和Phospho-STAT3的表達(dá)，用上述方法證實MC3T3-EI細(xì)胞礦化過程以及AMD3100抑制劑對礦化的影響情況。本實驗通過觀察細(xì)胞各時相成骨分化的變化，研究SDF-1/CXCR4通路及其下游蛋白STAT3在成骨分化過程中所發(fā)揮的作用。
　　 結(jié)果:
　　 (1) ALP活性檢測實驗結(jié)果表明，采用地塞米松、抗壞血酸及

9、β-磷酸甘油誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞在經(jīng)CXCR4特異性抑制劑AMD3100處理之后，在細(xì)胞成骨分化的第3、6、9天，與正常對照組相比，礦化組ALP活性整體呈升高的趨勢，且在第6天出現(xiàn)ALP活性峰值；相應(yīng)的抑制劑組ALP活性均呈降低趨勢，且在成骨分化第6天不同濃度的抑制劑組出現(xiàn)AMD3100劑量依賴趨勢。
　　 (2)茜素紅染色實驗發(fā)現(xiàn)，MC3T3-EI細(xì)胞在地塞米松、抗壞血酸和β-磷酸甘油介導(dǎo)的礦化誘導(dǎo)14、21天之后已能表

10、達(dá)成骨細(xì)胞表型。但是50μM及100μM的兩組抑制劑組均未見有統(tǒng)計學(xué)意義的茜素紅染色程度的減弱。
　　 (3)熒光定量PCR的結(jié)果表明，在MC3T3-EI細(xì)胞礦化誘導(dǎo)第6、9天，細(xì)胞成骨分化早期標(biāo)志性基因ALP、Runx2以及末期標(biāo)志性基因ANK、OCN的表達(dá)在地塞米松、抗壞血酸和β-磷酸甘油介導(dǎo)的礦化誘導(dǎo)作用下均出現(xiàn)上調(diào)趨勢，相比于礦化組，在AMD3100作用下，抑制劑組均出現(xiàn)相應(yīng)的下調(diào)趨勢。
　　 (4) Weste

11、m Blot結(jié)果表明，在MC3T3-E1細(xì)胞礦化誘導(dǎo)第6天，在地塞米松、抗壞血酸和β-磷酸甘油介導(dǎo)的礦化誘導(dǎo)作用下Phospho-STAT3表達(dá)量升高，而在AMD3100作用下Phospho-STAT3表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢。
　　 結(jié)論:
　　 本研究表明CXCR4抑制劑AMD3100對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化起到一定的調(diào)節(jié)作用，AMD3100在細(xì)胞成骨分化早期下調(diào)ALP活性，但在晚期并不能抑制MC3T3-E1細(xì)胞