Dlx2基因在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化及周期調(diào)控中的作用研究.pdf

1、目的：①檢測歧異同源盒基因Dlx 家族在MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化中的表達(dá)譜，篩選與成骨分化相關(guān)性密切的Dlx 家族成員作為候選研究基因。②探討候選研究基因過表達(dá)對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用。③探討候選研究基因過表達(dá)對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 方法：首先建立MC3T3-E1 細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化模型，采用real-time RT-PCR方法鑒定內(nèi)源性Dlx 基因家族6 個(gè)成員在成骨分化不同時(shí)期

2、的表達(dá)譜，篩選出與成骨分化趨勢相關(guān)性大的Dlx 基因成員（本研究中發(fā)現(xiàn)的是Dlx2 基因）。然后構(gòu)建Dlx2 過表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，測序驗(yàn)證。體外病毒轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 后，以嘌呤霉素行抗性篩選穩(wěn)定細(xì)胞株, 建立穩(wěn)定過表達(dá)Dlx2 基因的MC3T3-E1-Dlx2 細(xì)胞成骨分化模型，并以RT-PCR 和Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Dlx2 的表達(dá)譜。接下來，在穩(wěn)定過表達(dá)Dlx2 基因細(xì)胞模型中，應(yīng)用real-timeR

3、T-PCR 檢測Dlx2 過表達(dá)對(duì)部分成骨相關(guān)基因（ALP，OCN，Runx2，Msx2）表達(dá)的影響；以堿性磷酸酶（ALP）活性測定和茜素紅染色法檢測Dlx2 過表達(dá)對(duì)成骨分化的影響；最后，分別利用PI/Rnase 和Annexin V/PI 染色后的流式細(xì)胞分選技術(shù)，檢測Dlx2 基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 結(jié)果：⑴確定Dlx 基因家族6 個(gè)成員在MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)Dlx2

4、 基因與成骨分化趨勢相關(guān)性較大，作為研究候選基因。⑵成功構(gòu)建并鑒定獲得Dlx2 過表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。該病毒載體體外轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細(xì)胞后篩選出Dlx2 穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株MC3T3-E1-Dlx2，其mRNA 和蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。在成骨誘導(dǎo)過程中，MC3T3-E1-Dlx2 細(xì)胞ALP 值在第4d、7d、14d 均高于對(duì)照組細(xì)胞，茜素紅染色顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組和空白組染色深。Dlx2 過表達(dá)于成骨誘導(dǎo)早期就能顯著促進(jìn)ALP

5、 和 Msx2 的表達(dá)（P＜0.05），晚期則上調(diào)OCN 表達(dá)（P＜0.05），而Runx2 表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。⑶在Dlx2 基因穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系MC3T3-E1-Dlx2 中，PI/Rnase 染色后流式細(xì)胞分選顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組G1/G0 期細(xì)胞比例增加（P＜0.05），S 期和G2/M期細(xì)胞比例減少（P＜0.05＝。Annexin V/PI 染色后的流式細(xì)胞分選顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組早期凋亡和晚期凋亡均有明顯增加（P＜0