Dysferlin肌病miRNA表達(dá)模式的改變及miR-708在成肌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用.pdf

1、【目的】
　　系統(tǒng)檢測(cè)miRNA在Dysferlin肌病中的表達(dá)，初步探討miRNA與Dysferlin肌病的關(guān)系；結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討miR-708 mimic對(duì)成肌細(xì)胞的影響。
　　【方法】
　　1.結(jié)合臨床表現(xiàn)、HE染色和肌酶特殊染色、免疫組化等方法，篩選Dysferlin肌病病例為實(shí)驗(yàn)組，非特異性改變肌組織為對(duì)照組，取部分組織行miRNA芯片分析。
　　2.靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)作用于DYSF基因

2、的miRNA，結(jié)合miRNA芯片結(jié)果，選擇與 dysferlin肌病關(guān)系密切的miRNA，Taqman探針實(shí)時(shí)定量 PCR(RT-PCR)檢測(cè)其在人肌肉組織及小鼠成肌細(xì)胞C2C12增殖和分化過(guò)程中的表達(dá)。
　　3.合成miR-708 mimic，轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞C2C12，光學(xué)顯微鏡下觀察成肌細(xì)胞生長(zhǎng)分化情況，利用CCK-8檢測(cè)miR-708 mimic對(duì)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-708 mimic后的

3、增殖期C2C12細(xì)胞周期和凋亡情況，RT-PCR、Western blot檢測(cè)肌細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.免疫組化顯示：dysferlin蛋白在正常肌細(xì)胞的肌膜上呈線性表達(dá)，而在Dysferlin肌病組織中，dysferlin蛋白表達(dá)明顯減弱或缺失。光鏡下 Dysferlin肌病組織病理學(xué)改變：肌纖維呈輕-重度圓形萎縮伴多量肥大肌纖維形成，散在肌纖維見(jiàn)鑲邊空泡，個(gè)別肌纖維溶解壞死，內(nèi)核纖維明顯增多，

4、間質(zhì)纖維脂肪組織增生。
　　2.miRNA芯片結(jié)果顯示：Dysferlin肌病組織，116個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，176個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，部分miRNA表達(dá)水平異常與肌病時(shí)細(xì)胞內(nèi)各種酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝的調(diào)控及MAPK、Wnt信號(hào)通路等病理過(guò)程相關(guān)。結(jié)合芯片結(jié)果與靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇與DYSF基因關(guān)系密切的3個(gè)miR(-122、-346、-708)。其中miR-122、-346下調(diào)，miR-708上調(diào)。
　　3.篩選9例

5、Dysferlin肌病標(biāo)本進(jìn)行miRNA檢測(cè)，與非特異性改變肌組織對(duì)比，miR-122、-346、-708表達(dá)均升高（P值分別為0.04，0.04，0.03），其中miR-708在Dysferlin肌病患者肌組織的表達(dá)模式與芯片結(jié)果一致。
　　4.檢測(cè)miR-122、-346、-708在C2C12成肌細(xì)胞生長(zhǎng)分化過(guò)程中的表達(dá)，顯示增殖期miR-122、-346、-708表達(dá)量較低，分化早期miR-122、-346、-708均升高，

6、但隨著C2C12分化時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-122表達(dá)水平基本不變，miR-346、-708表達(dá)下調(diào)，其中miR-708下調(diào)更明顯，達(dá)到增殖期水平。
　　5. C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-708 mimic后，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)成肌細(xì)胞增殖受到明顯抑制。CCK-8檢測(cè)顯示mimic組C2C12抑制率為（15.40±0.0052）％，（P=0.004），明顯高于NC組（2.87±0.0034）%；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-708 mi

7、mic后，C2C12細(xì)胞周期變化明顯，S期明顯縮短（20.87%），G1期明顯延長(zhǎng)(68.64%)，NC組分別為45.66%、42.69%，而細(xì)胞凋亡指數(shù)mimic組與NC組無(wú)顯著差異；RT-PCR及 Western blot結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照（NC組）相比，轉(zhuǎn)染miR-708 mimic后MYOD、MYOG、MHC、DYSF蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。
　　【結(jié)論】
　　1.Dysferlin肌病可引起多種miRNA表達(dá)模式