1、CRH對不同狀態(tài)妊娠子宮肌BK-,Ca-表達的調節(jié)作用;2、H-,2-S合成酶及K-,ATP-通道在不同狀態(tài)妊娠子宮肌的表達.pdf

1、研究表明，啟動分娩的許多信號可通過調節(jié)離子通道進而改變子宮平滑肌的舒縮狀態(tài)使得子宮興奮。大電導鈣離子激活的鉀通道(BKCa)，作為在子宮肌上表達量最高的鉀離子通道在調控子宮肌的收縮性方面起重要作用。研究表明，促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)及其相關肽可通過CRH-R1和CRH-R2兩種不同亞型的受體介導的作用，調節(jié)子宮肌的舒縮狀態(tài)，進而參與妊娠和分娩的諸多環(huán)節(jié)。然而其作用的具體靶點目前還不是很清楚。因此在本課題的第一部分，我們以原代培

2、養(yǎng)的臨產和未臨產子宮平滑肌細胞為模型，使用CRHR1和CRHR2的特異受體拮抗劑antalarmin和astressin2B、廣譜受體拮抗劑astressin，研究了子宮肌不同狀態(tài)下內源性CRH通過CRHR1和CRHR2介導的對BKCa的調節(jié)作用；并且通過給予外源性的CRH，進一步叨確了CRH通過不同受體介導的調節(jié)BKCa的綜合作用。
　　 妊娠末期分娩的啟動機制極其復雜，體內各類激素水平、收縮相關蛋白表達量及其他因素的改變共同

3、作用進而啟動分娩的進程，其中氣體信號分子的作用逐漸為人們所認識。已有研究表明，NO和CO能通過GC-cGMP途徑舒張子宮平滑肌，參與其靜息狀態(tài)的維持。H2S作為第三類氣體信號分子，可通過激活ATP敏感的鉀離子通道(KATP)舒張血管平滑肌，但目前對其在子宮肌上的表達和功能了解還很有限。因此在本課題的第二部分中，我們對內源性血管舒張因子H2S及其下游靶分子KATP通道是否參與妊娠及分娩展開研究，著重研究了不同狀態(tài)子宮肌中H2S合成相關酶C

4、BS和CSE的表達；并測定其合成H2S的速率，進一步研究H2S對不同狀態(tài)子宮平滑肌的調節(jié)作用以及KATP構成亞基在不同狀態(tài)子宮平滑肌中mRNA及蛋白水平的表達。
　　 實驗結果如下：
　　 一、CRH通過不同受體對妊娠子宮平滑肌細胞上BKCa的調節(jié)作用
　　 1.免疫組化發(fā)現(xiàn)，子宮平滑肌組織中存在內源性CRH的表達。
　　 2.放射性免疫方法測定原代培養(yǎng)的臨產狀態(tài)子宮平滑肌細胞內源性CRH的分泌量要高于未

5、臨產狀態(tài)子宮平滑肌細胞。
　　 3.分別使用CRHR1的特異性拮抗劑antalarmin和CRHR2的特異性拮抗劑astressin2B處理細胞，發(fā)現(xiàn)在未臨產子宮平滑肌細胞上，antalarmin下調BKCa核心α亞基和調節(jié)β亞基的mRNA和蛋白表達，astressin2B上調兩種亞基的mRNA和蛋白表達；在臨產子宮平滑肌細胞上，antalarmin上調α亞基和β亞基的mRNA和蛋白的表達，astressin2B下調α亞基的mR

6、NA和蛋白的表達，但對β亞基的表達沒有明顯調節(jié)作用。并且兩種特異性拮抗劑的對α亞基和β亞基調節(jié)作用在未臨產及臨產子宮肌細胞上存在劑量依賴效應及時間依賴效應。
　　 4.使用外源性CRH處理子宮平滑肌細胞，發(fā)現(xiàn)在未臨產子宮平滑肌細胞上α亞基和β亞基的mRNA和蛋白表達均呈劑量依賴性和時間依賴性增加；在臨產子宮肌細胞上，α亞基和β亞基的mRNA和蛋白表達減少，亦存在劑量及時間依賴效應。
　　 5.在未臨產子宮肌細胞上，外源性

7、CRH對α亞基和β亞基表達的上調作用，可以被CRHR1的特異性拮抗劑antalarmin完全阻斷，不能被CRHR2的特異性拮抗劑astressin2B阻斷，可被受體廣譜拮抗劑astressin部分阻斷。這表明外源性CRH在未臨產子宮肌上通過不同受體介導的作用不盡相同，但主要通過CRHR1增加BKCa的α亞基和β亞基的表達。在臨產子宮肌細胞上，外源性CRH對α亞基表達的下調作用，可被antalarmin完全阻斷，不能被astressin2

8、B阻斷，可被astressin部分阻斷。而β亞基表達受外源性CRH下調的趨勢，只能被antalarmin和astressin部分阻斷。這表明在臨產子宮平滑肌上，外源性CRH是通過CRHR1介導的作用，下調了BKCa的表達。
　　 6.利用RNA干擾技術使原代培養(yǎng)的未臨產子宮肌細胞CRHR1及CRHR2分別表達減少。在此模型上觀察到，CRH可下調si-CRHR1轉染的未臨產子宮肌細胞上BKCa的表達，該作用可被CRHR2特異性阻斷

9、劑逆轉；CRH對si-CRHR2轉染的子宮肌細胞上BKCa的表達具反方向調節(jié)作用。這一結果證實未臨產子宮平滑肌上CRH通過CRHR1介導對BKCa的表達的上調作用，CRHR2介導的作用與之相反。
　　 二、不同狀態(tài)妊娠子宮平滑肌中H2S合成相關酶和KATP通道的表達
　　 1.免疫組化證實在子宮平滑肌組織上存在H2S兩種合成相關酶CBS和CSE的表達。
　　 2.臨產狀態(tài)的子宮平滑肌下段中CBS的mRNA和蛋白表

10、達量均比未臨產狀況明顯下降，而CSE只存在mRNA水平上表達量下調，蛋白水平表達沒有明顯變化。表明子宮平滑肌CBS表達量的改變可能導致內源性H2S的生成量變化，而未臨產子宮肌下段中H2S合成酶較高的表達量與平滑肌靜息狀態(tài)的維持密切相關。
　　 3.極譜法實時測定不同狀態(tài)妊娠子宮肌下段中H2S合成酶生成H2S的速率，結果表明未臨產子宮肌中生成H2S速率要遠遠高于臨產子宮肌。提示由于H2S具有舒張平滑肌的作用，其高生成率亦可能是妊娠

11、期間維持子宮肌靜息狀態(tài)的影響因素之一。
　　 4.免疫組織化學的方法表明，構成KATP通道的四種亞基(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)在子宮平滑肌上均有表達。
　　 5.熒光實時定量PCR結果顯示，在臨產子宮肌上兩種通道核心組成單位Kir6.1和Kir6.2的表達量比未臨產子宮肌上的表達量下降，而兩種調節(jié)組成單位SUR1和SUR2B表達并無明顯變化。在蛋白表達水平上，臨產狀態(tài)下的Kir6.1和Kir6.

12、2的表達量明顯減少，而SUR1的表達量上升，同時SUR2B的表達沒有發(fā)生明顯變化。這說叨KATP通道在不同狀態(tài)的子宮肌上主要是通過改變其核心組成單位的表達來調節(jié)子宮平滑肌的靜息狀態(tài)。
　　 結論：
　　 本研究表明，CRH通過其不同亞型受體介導的作用對子宮平滑肌中BKCa的表達起到相反的調節(jié)作用，但以CRHR1的作用為主，BKCa表達量的改變可能是CRH對子宮肌組織雙向調節(jié)作用的機制之一。此外，氣體信號分子H2S及其合成