水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物重要病原菌等溫?cái)U(kuò)增芯片技術(shù)的研究.pdf

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大及養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖水體污染的日益加劇，使得水產(chǎn)動(dòng)物疾病暴發(fā)日趨頻繁和嚴(yán)重。副溶血弧菌(Vibrio parahaemozyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、輪蟲弧菌(Vibrio rotiferian

2、us)、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）及海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）等9種致病菌廣泛存在于水產(chǎn)品和養(yǎng)殖水體中，對(duì)人體健康和水產(chǎn)動(dòng)物造成了嚴(yán)重威脅。因此，需要建立快速有效的方法和手段實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中致病菌的早期檢測(cè)、養(yǎng)殖環(huán)境的實(shí)時(shí)監(jiān)控和預(yù)警。
　　本論文首先通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）聯(lián)合橫

3、向流動(dòng)試紙條（lateral flow dipstick，LFD），建立了LAMP-LFD技術(shù)，能夠在50 min時(shí)間內(nèi)分別完成對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌、海豚鏈球菌和創(chuàng)傷弧菌的快速檢測(cè)，其靈敏度達(dá)到了3.2×101 cfu/mL或0.64 cfu/反應(yīng)、8.7×101 cfu/mL和3.7×102 cfu/mL或7.4 cfu/反應(yīng)。參考單核細(xì)胞增生李斯特菌、海豚鏈球菌和創(chuàng)傷弧菌確定的LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，并結(jié)合已公布的副溶血弧菌、

4、溶藻弧菌、鰻弧菌，確定了LAMP反應(yīng)的統(tǒng)一體系和條件，并據(jù)此篩選出哈維氏弧菌、河流弧菌和輪蟲弧菌的最適引物組合。進(jìn)而又將 LAMP技術(shù)與微流體芯片技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，建立了可同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌等9種病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流體芯片檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，使用200μL的移液器可實(shí)現(xiàn)一次性加樣?？商禺愋詸z出9個(gè)病原菌，對(duì)嗜水氣單胞菌等其他病原菌的檢測(cè)為陰性。該方法的檢測(cè)靈敏度范圍為0.40-8.91pg/反應(yīng)，在35min內(nèi)即可完成對(duì)病原菌的