糖尿病大鼠骨骼肌中脂肪酸和脂肪增加的原因初探.pdf

1、目的：骨骼肌細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和甘油三酯的積聚是2型糖尿病(T2DM)狀態(tài)下，導(dǎo)致骨骼肌對(duì)胰島素的敏感性降低，引起胰島素抵抗的重要原因。 脂肪酸是骨骼肌的主要能量物質(zhì)之一。脂肪酸在線粒體和過(guò)氧化物酶體中經(jīng)β-氧化途徑進(jìn)行氧化。β-氧化途徑包括氧化、加水、脫氫、硫解四步反應(yīng)。線粒體β-氧化途徑主要氧化短鏈、中鏈和大部分長(zhǎng)鏈脂肪酸。肌型-肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(M-CPTⅠ)是其限速酶。極長(zhǎng)鏈脂肪酸經(jīng)過(guò)氧化物酶體β-氧化途徑氧化。過(guò)氧化物酶體中

2、存有兩條β-氧化途徑。一條途徑主要與直鏈脂肪酸的氧化有關(guān)，由脂酰輔酶A氧化酶1(ACOX1)、L-雙功能蛋白(LBP)、硫解酶組成；另一條途徑主要與2-甲基支鏈脂肪酸的氧化有關(guān)，由ACOX3、D-雙功能蛋白(DBP)、固醇攜帶蛋白X組成。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR α)可通過(guò)調(diào)節(jié)其下游基因(如CPT Ⅰ、ACOX等)表達(dá)，影響骨骼肌脂肪酸β-氧化。脂肪酸在骨骼肌細(xì)胞中還可合成甘油三酯。二?；视王；D(zhuǎn)移酶1(DGAT1)是甘

3、油三酯合成的限速酶。 T2DM狀態(tài)下，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)積聚大量的脂肪酸和甘油三酯，導(dǎo)致骨骼肌對(duì)胰島素敏感性降低。但脂肪酸和甘油三酯積聚的分子機(jī)制還不清楚。這是否與骨骼肌中脂肪酸在線粒體及過(guò)氧化物酶體中的β-氧化降低以及脂肪酸在胞漿中的酯化增加有關(guān)呢?未見(jiàn)報(bào)道。 基于上述原因，本研究以高脂飲食和小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的T2DM大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用口服糖耐量實(shí)驗(yàn)、胰島素敏感指數(shù)測(cè)定以及正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)等確定其產(chǎn)生胰島素抵

4、抗；組織油紅O染色、組織游離脂肪酸和甘油三酯測(cè)定等實(shí)驗(yàn)確定游離脂肪酸、甘油三酯在骨骼肌中聚集后，用RT-PCR.法觀察骨骼肌線粒體和過(guò)氧化物酶體脂肪酸β-氧化途徑中相關(guān)酶(M-CPT I、ACOX1、ACOX3、LBP、DBP、)基因、甘油三酯合成的限速酶DGAT1基因以及核受體PPAR α基因mRNA的表達(dá)情況；用氣相色譜分析骨骼肌組織游離脂肪酸的種類；用分光光度法測(cè)定脂肪酸β-氧化活性。從脂肪酸氧化分解以及脂肪酸合成甘油三酯的角度，

5、探討細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和甘油三酯積聚的原因，為T2DM的防治以及發(fā)病原因的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、動(dòng)物分組及取材成年雄性清潔級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con)和2型糖尿病組(DM)。Con組給予普通標(biāo)準(zhǔn)飲食，DM組給予高脂飲食。自喂養(yǎng)高脂飲食八周后，通過(guò)高胰島素正葡萄鉗夾實(shí)驗(yàn)等證實(shí)DM組產(chǎn)生胰島素抵抗；一周后，腹腔注射STZ 27mg/kg；72h后，檢測(cè)空腹血糖，大于7.8mmol/L的大鼠確定為2型糖尿病大鼠

6、。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在繼續(xù)喂養(yǎng)6周后處死，頸動(dòng)脈取血，血清用于血糖、甘油三酯的測(cè)定；骨骼肌組織用于組織切片、RNA及脂質(zhì)提取。 2、口服糖耐量試驗(yàn)大鼠空腹12h后，50％葡萄糖灌胃，檢測(cè)0，30，60，120 min血糖，分析兩組大鼠血糖水平變化。 3.胰島素敏感指數(shù)的測(cè)定大鼠空腹12h后采血，檢測(cè)胰島素水平和空腹血糖水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)。 4、正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)空腹?fàn)顟B(tài)下，靜注胰島素使血漿胰島素維持較高水平，同時(shí)靜

7、脈補(bǔ)充葡萄糖使血糖維持基礎(chǔ)水平。取穩(wěn)態(tài)下葡萄糖輸注速率來(lái)評(píng)價(jià)胰島素敏感性。 5、葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖6、氧化酶法測(cè)定血清甘油三酯 7、觀察骨骼肌油紅O染色 8、骨骼肌組織甘油三酯的測(cè)定骨骼肌組織用異丙醇勻漿，離心取上清，用于甘油三酯測(cè)定。 9、骨骼肌組織總游離脂肪酸測(cè)定骨骼肌組織用生理鹽水勻漿，離心取上清，用于脂肪酸測(cè)定。 10 氣相色譜儀測(cè)定骨骼肌脂肪酸百分含量11 骨骼肌組織各相關(guān)基因mRN

8、A相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定用Trizol法提取RNA，用RT-PCR法測(cè)定M-CPTI，ACOX1、ACOX3、LBP、DBP、PPAR α及DGAT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 結(jié)果： 1、口服糖耐量試驗(yàn)0，30，60，120 min血糖值，DM組均高于Con組(P<0.01)，表明，大鼠已產(chǎn)生糖耐量降低。 2、胰島素敏感指數(shù)(ISI)DM組較Con組，ISI降低(-5.33±0.26 vs-4.60±0.14，P<0.

9、01)，表明糖尿病大鼠胰島素敏感性降低。 3、正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)血糖穩(wěn)定后，葡萄糖輸注速率，DM組較Con組降低(20.44±1.99mg/kg.min vs 27.97±1.72 mg/kg.min，P<0.01)，表明糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗。 4、血糖 DM組的血糖(15.55±2.69 mmol/L)均高于7.8mmol/L(本文所采用的T2DM血糖標(biāo)準(zhǔn))，且明顯高于Con組(5.25±0.52mmo

10、l/L，P<0.01)。 5、血清甘油三酯DM組血清甘油三酯明顯高于Con組(2.26±0.51mmol/L vs 1.09±0.20 mmol/L，P<0.01)。 6、骨骼肌組織油紅O染色DM組骨骼肌細(xì)胞中脂滴增多。 7、骨骼肌組織甘油三酯、游離脂肪酸DM組骨骼肌組織甘油三酯(38.1±7μmol/g組織 vs 9.42±1.84μmol/g組織，P<0.01)、游離脂肪酸(15.57±2.92μmol/g

11、provs 9.80±1.39μmol/g pro,P<0.01)明顯高于Con組。 8、氣相色譜儀測(cè)定骨骼肌脂肪酸含量DM組較Con組，十六烷酸、十八烷酸、十八烯酸、二十六烷酸，各成分百分含量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 9、骨骼肌各相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化9.1 骨骼肌M-CPT I mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化脂肪酸在線粒體中β-氧化的限速酶M-CPT I mRNA相對(duì)表達(dá)量，DM組為1.303±0.260，Con組為1.4

12、37±0.283，兩組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 9.2骨骼肌LBP、ACOX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化過(guò)氧化物酶體中β-氧化的第一條途徑的部分酶的基因，DM組和Con組相比，ACOX1 mRNA(1.377±0.082 vs1.498±0.187，P>0.05)表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LBP mRNA(0.526±0.071 vs 0.812±0.121，P<0.01)表達(dá)降低。9.3骨骼肌DBP、ACOX3 mRNA的相

13、對(duì)表達(dá)量的變化過(guò)氧化物酶體中β-氧化的第二條途徑的部分酶的基因，DM組和Con組相比，ACOX3 mRNA(0.290±0.059 vs0.508±0.096，P<0.01)表達(dá)降低，DBP mRNA(0.746±0.145vs 0.764±0.116，P>0.05)表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義9.4骨骼肌PPARα mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化DM組和Con組相比，PPARα mRNA(0.460±0.044 vs1.089±0.213，P<0

14、.01)表達(dá)降低，表明糖尿病大鼠骨骼肌細(xì)胞中PPARα表達(dá)下調(diào)。9.5骨骼肌DGAT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化DM組和Con組相比，甘油三酯合成的關(guān)鍵酶，DGAT1mRNA(0.690±0.124 vs 0.392±0.054，P<0.01)表達(dá)增加。 結(jié)論： 1.2型糖尿病狀態(tài)下，大鼠骨骼肌組織總游離脂肪酸含量增多可能與骨骼肌PPARα表達(dá)降低，過(guò)氧化物酶體脂肪酸β-氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)下降有關(guān)。 2.