CypA-CD147活化B細(xì)胞參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及急性B淋巴細(xì)胞白血病機(jī)制的探討.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，雖然其確切的發(fā)病機(jī)制還不清楚，但普遍認(rèn)為可能是由外源性或內(nèi)源性的抗原對(duì)具有某些遺傳易感背景的人觸發(fā)一系列在滑膜中的自身免疫反應(yīng)。其臨床特點(diǎn)為累及周身關(guān)節(jié)的增殖性和侵蝕性滑膜炎，是類似于“局限性惡性腫瘤(locallyinvasivetumor)”的增生性和破壞性病變，呈進(jìn)行性發(fā)展，自行緩解罕見。
　　以往的研究證實(shí)了RA的滑膜細(xì)胞及巨噬細(xì)胞通

2、過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞及加重疾病的病情，而其中CD147分子則是已知的一個(gè)MMPs重要調(diào)節(jié)因子。CD147又稱為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑(extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN)，廣泛表達(dá)于人血管內(nèi)皮細(xì)胞、外周血細(xì)胞、造血系統(tǒng)起源的細(xì)胞表面，屬于免疫球蛋白超家族，細(xì)胞環(huán)親素A(yclophilinA

3、，CypA)的受體之一。在RA關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量存在的CypA同樣作為一個(gè)重要的促炎因子，在其他許多炎性及腫瘤等疾病中的作用都見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室以往的研究顯示CypA對(duì)RA滑液中的單個(gè)核細(xì)胞的趨化作用顯著高于正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，且這一作用可被抗CD147抗體所阻斷，提示了單個(gè)核細(xì)胞膜CD147分子可能參與了CypA對(duì)單個(gè)核細(xì)胞的趨化調(diào)節(jié)作用。但是到目前為止，對(duì)于CypA與CD147相互作用于淋巴細(xì)胞，尤其是B淋巴細(xì)胞的報(bào)道未曾見到。RA的滑

4、膜下層可有大量的T細(xì)胞(CD4＋細(xì)胞為主)、B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤，侵入的單個(gè)核細(xì)胞集聚在一起可形成淋巴樣濾泡，少數(shù)發(fā)展成生發(fā)中心；生發(fā)中心的漿細(xì)胞有合成免疫球蛋白和RF的能力。
　　然而，RA滑膜局部B細(xì)胞活化增生以及漿細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不明確，通過對(duì)CypA與CD147相互作用、CypA在RA滑液內(nèi)大量存在及CD147在RA中單核/巨噬細(xì)胞高表達(dá)等文獻(xiàn)回顧以及本實(shí)驗(yàn)在單個(gè)核細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本課題擬觀察這一相互作

5、用在B淋巴細(xì)胞是否也存在，初步研究CypA對(duì)滑膜及滑液中B細(xì)胞上CD147的表達(dá)，以及對(duì)B細(xì)胞活化分泌自身抗體作用的研究。
　　流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)分析正常個(gè)體的外周血提示：B細(xì)胞的一小部分，T細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)EMMPRIN，然而在ATLL患者中，表達(dá)EMMPRIN的T細(xì)胞數(shù)目是多的，蛋白的表達(dá)水平是異常高的。體外，EMMPRIN表達(dá)陽性的人類T細(xì)胞親淋巴病毒Ⅰ型(humanT-celllymphom

6、avirus，HTLV-1)轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞(transformedlymphocyte，MT-2)和EMMPRIN表達(dá)陰性人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)比單獨(dú)培養(yǎng)提高了前-MMP-2(明膠酶A)和活化MMP-2的產(chǎn)生。這些刺激可被拮抗EMMPRIN的活化阻斷蛋白抑制。
　　近年來大量的資料顯示慢性炎癥在一些腫瘤從癌前階段演化為完全癌癥中發(fā)揮重要角色。腫瘤和炎癥之間的鏈接很長時(shí)間都成為人們的疑點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究顯示CypA通過單個(gè)核細(xì)胞膜C

7、D147分子參與對(duì)該細(xì)胞的趨化調(diào)節(jié)作用，CD147分子在健康人成熟單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)與增生的炎癥細(xì)胞(癌前細(xì)胞)及腫瘤細(xì)胞的表達(dá)呈依次增高的趨勢。但關(guān)于CD147在炎癥和腫瘤中活化B細(xì)胞上的表達(dá)水平研究尚未見報(bào)道，以及在B細(xì)胞不同活化階段cyclophilin-CD147作用發(fā)生疾病機(jī)制的研究尚未探討。
　　因此，本課題研究將CypA通過CD147分子相互作用、CD147分子介導(dǎo)信號(hào)通路的研究思路用于CD147在B細(xì)胞不同發(fā)育轉(zhuǎn)化階

8、段表達(dá)中的研究，該結(jié)果對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CypA、CD147分子及兩者相互作用復(fù)合物在炎癥、癌前病變以及腫瘤轉(zhuǎn)化過程中發(fā)病機(jī)制的作用有著重要的意義，并為探索炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)化中的生物標(biāo)記及靶向治療提供了良好的理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.CyclophilinA-CD147活化B細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用
　　收集RA患者嚴(yán)重骨侵襲者取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，首先制備組織切片，采用免疫組化染色(分別用CD19、CD35、CD38標(biāo)記B淋巴

9、細(xì)胞、濾泡樣樹突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞)觀察RA滑膜組織中B淋巴細(xì)胞生發(fā)中心的形成，進(jìn)而免疫組化染色觀察CD147在其中的表達(dá)分布特點(diǎn)；分離RA滑液單個(gè)核細(xì)胞，加入CypA，B細(xì)胞活化因子(BAFF)，脂多糖(LPS)作用細(xì)胞，于12、24、48h，分別收集培養(yǎng)懸浮單個(gè)核細(xì)胞，采用三重標(biāo)記法(CD147-FITC、CD3-PrecP、CD19-APC)，流式細(xì)胞術(shù)法測定相關(guān)分子。檢測不同刺激后CD19+B細(xì)胞表面CD147表達(dá)MFI的變化；收集

10、CypA，BAFF，LPS作用后滑液細(xì)胞的培養(yǎng)上清，檢測RF亞型，抗CCP抗體，及免疫球蛋白的分泌水平，并用滑液中總免疫球蛋白校正。觀察不同刺激作用后自身抗體分泌水平。
　　2.急性B淋巴細(xì)胞白血病為代表的血液系統(tǒng)腫瘤中B細(xì)胞CD147的表達(dá)
　　為了研究CD147在急性白血病患者骨髓白血病細(xì)胞上的表達(dá)，尤其是幼稚B細(xì)胞上的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)三色免疫熒光直接標(biāo)記技術(shù)檢測，比較健康供者和急性白血病患者及其治療緩解期患者

11、骨髓中不同細(xì)胞亞群尤其是白血病細(xì)胞上CD147表達(dá)的差異，并追蹤觀察骨髓移植或者化療后CD147表達(dá)的變化。
　　3.CypA通過CD147促進(jìn)B淋巴瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究
　　為了進(jìn)一步深入研究是否CypA通過CD147途徑參與B細(xì)胞的免疫學(xué)機(jī)制，并排除其它因素的干擾，本研究選取表型為CD19+CD10+CD147high的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞，體外經(jīng)CypA作用后經(jīng)尾靜脈注入Scid小鼠體內(nèi)，觀察Raji細(xì)

12、胞在Scid小鼠體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移情況以及分泌MMP等方面的功能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.CD147在RA滑膜淋巴樣組織中的表達(dá)與分布，CypA對(duì)滑液B細(xì)胞表達(dá)CD147的調(diào)節(jié)
　　15例RA患者，均具有膝關(guān)節(jié)嚴(yán)重骨侵襲以及典型RA臨床表現(xiàn)，取滑膜標(biāo)本收集滑液分離單個(gè)核細(xì)胞。組織學(xué)和免疫組化結(jié)果顯示，15例RA患者滑膜標(biāo)本中13例有生發(fā)中心樣的組織結(jié)構(gòu)，并且13例RA滑膜組織濾泡樣生發(fā)中心中均存在不同程度的CD147的表

13、達(dá)。其中陽性6例，強(qiáng)陽性7例。鏡下計(jì)數(shù)在13例RA滑膜淋巴濾泡中CD147表達(dá)陽性的細(xì)胞，淋巴細(xì)胞30±8％，濾泡樣樹突裝細(xì)胞細(xì)胞平均為32±7％，血管內(nèi)皮細(xì)胞平均為38±11％，漿細(xì)胞細(xì)胞幾乎不表達(dá)；進(jìn)一步本實(shí)驗(yàn)通過CypA，BAFF，LPS作用以上13例滑膜存在淋巴濾泡樣組織結(jié)構(gòu)RA患者滑液單個(gè)核細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞及上清，檢測不同刺激后CD19+B細(xì)胞表面CD147表達(dá)MFI的變化及自身抗體分泌水平，提示：CypA(200ng/ml

14、)，BAFF(25ng/ml)，LPS(20ng/ml)作用后48hCD19+B細(xì)胞表面CD147表達(dá)MFI、RF和anti-CCP水平最高，顯著高于刺激前水平(p<0.01)，且CypA與BAFF、LPS作用間無顯著差異(p>0.05)。
　　2.急性B淋巴細(xì)胞白血病為代表的血液系統(tǒng)腫瘤中B細(xì)胞CD147的表達(dá)
　　流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，急性白血病初發(fā)患者的骨髓中，白血病細(xì)胞膜表面CD147表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(meanflu

15、orescenceintensity，MFI)(97.96±14.07，p<0.01)顯著高于健康供者(66.61±15.59)和治療緩解期患者(73.72±8.54)，其他細(xì)胞群(淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，有核紅細(xì)胞)CD147表達(dá)的MFI亦顯著高于健康供者及治療緩解期患者(p<0.01)；進(jìn)一步比較急性B淋巴細(xì)胞白血病初發(fā)患者白血病細(xì)胞CD147的表達(dá)(105.96±5，p<0.01)顯著高于健康供者白血病細(xì)胞群中幼稚B系細(xì)胞(CD10

16、/CD19)(35.76±8.49)，而急性B淋巴細(xì)胞白血病骨髓移植治療后CD147的表達(dá)亦降低(58.46±1.26，比較健康供者p<0.05)。同時(shí)，分析比較不同急性白血病亞型的CD147表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，急性B淋巴細(xì)胞白血病(ALL-B)骨髓中白血病細(xì)胞亞群CD147的表達(dá)(105.96±5)顯著高于患者本人骨髓中成熟B淋巴細(xì)胞(43.46±12.34，p<0.01)。并在ALL-B不同亞型的患者骨髓中白血病細(xì)胞亞群CD147的表達(dá)時(shí)發(fā)

17、現(xiàn)，越幼稚亞型的ALL-B患者骨髓中白血病細(xì)胞亞群CD147的表達(dá)越高，隨著幼稚細(xì)胞百分率的增高CD147的表達(dá)也增高，并且其表達(dá)在治療緩解期患者的表達(dá)中有回歸健康供者表達(dá)特點(diǎn)的趨勢，這一免疫分型的分布特點(diǎn)有一定的規(guī)律性。然而分析其它急性白血病的幼稚細(xì)胞并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。
　　3.CypA通過CD147促進(jìn)B淋巴瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究
　　流式細(xì)胞術(shù)顯示Raji細(xì)胞大多為CD19＋CD10＋細(xì)胞(約占85％)，證明

18、其為較幼稚的B淋巴細(xì)胞，并且表面均表達(dá)CD147，MFI達(dá)到337.56，即為CD19+CD10+CD147high表達(dá)，符合進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的要求。體外用CypA(200ng/ml)作用Raji細(xì)胞培養(yǎng)48h后，經(jīng)尾靜脈免疫注入Scid小鼠，3周后觀察其PBMC，骨髓細(xì)胞，肝細(xì)胞，脾臟細(xì)胞中CD147+細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)：用未經(jīng)處理的Raji細(xì)胞免疫小鼠，其骨髓細(xì)胞中(15.07±5.43％)、肝細(xì)胞中分別為(25.75±6.58

19、％)、脾臟細(xì)胞中分別為(19.13±4.33％)，CD19+CD10+CD147+細(xì)胞百分率顯著低于經(jīng)CypA作用的Raji細(xì)胞免疫小鼠，分別為(21.11±6.02％)、(47.77±10.23％)、(39.65±7.23％，p<0.01)。而對(duì)小鼠的肝臟和脾臟的組織學(xué)和免疫組化研究顯示，輸注未經(jīng)或CypA作用過的Raji細(xì)胞，兩組小鼠CD19+CD10+CD147+細(xì)胞熒光表達(dá)沒有顯著差異。并且MMP-9組成以溶解形式存在于免疫小鼠

20、血清中，體外CypA(200ng/ml)作用Raji細(xì)胞48h后，Scid小鼠血清MMP-9水平顯著高于未經(jīng)處理的Raji細(xì)免疫組。
　　結(jié)論：
　　本研究提示CD147可能作為生物標(biāo)志用于急性白血病特別是急B淋的早期診斷和預(yù)測治療后復(fù)發(fā)；CypA、CD147有可能是RA和急性白血病特別是急B淋的藥靶。深入研究將有助于闡明CypA與CD147相互作用參與炎癥、癌前病變以及腫瘤轉(zhuǎn)化過程的發(fā)病機(jī)制，探索抗炎和抗腫瘤靶向治療的新策