Sulfiredoxin-1經(jīng)Nrf2-ARE通路保護(hù)PC12細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中等腦缺血性疾病有著居高不下的發(fā)病率、致殘率與死亡率，給社會(huì)造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)代價(jià)。腦缺血再灌注使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成活性氧產(chǎn)生與機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)清除能力的平衡失調(diào)。
　　內(nèi)源性小分子抗氧化蛋白，Sulfiredoxin-1，屬于Sulfiredoxin(Srx)抗氧化蛋白家族的成員。有研究表明處于氧化/抗氧化失衡狀態(tài)的慢性肺部阻塞性疾病患者的肺組織中，內(nèi)源性抗氧化酶Srxn1的表達(dá)極低，而過(guò)表達(dá)Srxn1可以保

2、護(hù)肺臟組織免受氧化攻擊損傷，也可以保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞免受過(guò)氧化物的氧化性損傷。本課題擬采用干擾Srxn1基因表達(dá)，在體外以H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模擬神經(jīng)元在腦缺血再灌注中的氧化損傷，探討Sulfiredoxin-1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　(1)應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將Srxn1基因干擾質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，

3、以β-actin為內(nèi)參，Western blot方法檢測(cè)Srxn1蛋白水平的表達(dá)，半定量檢測(cè)Srxn1mRNA水平的表達(dá)，確認(rèn)干擾效率。
　　(2)以H2O2濃度為0、180μmol/L的培養(yǎng)液作用于各組細(xì)胞24h后，MTS方法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。
　　(3)H2O2處理各組細(xì)胞后，破碎各組細(xì)胞，收集樣本，按試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)MDA含量。
　　(4)H2O2處理各組細(xì)胞后，分別提取細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白，以β-acti

4、n為胞漿內(nèi)參，Lamin A為胞核內(nèi)參，用Western blot方法檢測(cè)Nrf2、actin蛋白水平。
　　(5)H2O2處理各組細(xì)胞后，分別提取各組細(xì)胞總蛋白與總RNA，以β-actin為內(nèi)參，半定量PCR檢測(cè)HO-1、NQO1mRNA水平，Westernblot檢測(cè)蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　(1)成功轉(zhuǎn)染攜帶siRNA的Srxn1干擾質(zhì)粒與陰性質(zhì)粒，RT-PCR及Western blot證實(shí)Srxn1干擾組的S

5、rxn1 mRNA及蛋白表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染組與陰性轉(zhuǎn)染組比較明顯減低，未轉(zhuǎn)染組與陰性轉(zhuǎn)染組表達(dá)無(wú)差異。
　　(2)細(xì)胞生存率(％):PC12細(xì)胞經(jīng)200μM的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞活力下降，而干擾Srxn1可以加重這一損傷。
　　(3)MDA含量(nmol/mgpro):各組細(xì)胞暴露于含H2O2的培養(yǎng)液12h后，檢測(cè)MDA含量均增加，Srxn1干擾組（5.507±0.29）的MDA水平高于未轉(zhuǎn)染組與

6、陰性載體組，未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組相比差異不顯著（P＞0.05）。
　　(4)Nrf2蛋白水平表達(dá):H2O2損傷后，各組細(xì)胞胞漿內(nèi)Nrf2蛋白水平表達(dá)下降，而Srxn1干擾組的這一下降趨勢(shì)要弱于未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組。而各組細(xì)胞在H2O2損傷后細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白水平表達(dá)升高，Srxn1干擾組Nrf2蛋白水平表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組要低(P＜0.05)。
　　(5)actin蛋白水平表達(dá):H2O2處理后，各組細(xì)胞胞漿內(nèi)act

7、in蛋白水平表達(dá)下降，而Srxn1干擾組的這一下降趨勢(shì)要弱于未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組。而各組細(xì)胞在H2O2損傷后細(xì)胞核內(nèi)的actin蛋白水平表達(dá)升高，Srxn1干擾組的actin蛋白水平表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組要低(P＜0.05)。
　　(6)HO-1的表達(dá):各組細(xì)胞暴露于H2O212h后，HO-1 mRNA的表達(dá)在未轉(zhuǎn)染組(0.729vs.0.458)、陰性轉(zhuǎn)染組(0.625 vs.0.463)及Srxn1干擾組(0.53 vs.

8、0.478)均較損傷前明顯升高，而Srxn1干擾組這一趨勢(shì)明顯低于其他兩組(p＜0.05)，未轉(zhuǎn)染組與陰性轉(zhuǎn)染組比較無(wú)差異（P＞0.05）。與H2O2損傷前相比，HO-1的蛋白水平表達(dá)在未轉(zhuǎn)染組(1.107 vs.0.63)、陰性轉(zhuǎn)染組(1.019 vs.0.581)及Srxn1干擾組(0.754vs.0.644)均明顯升高，而Srxn1干擾組的升高明顯低于其他兩組(P＜0.05)，未轉(zhuǎn)染組與陰性轉(zhuǎn)染組比較無(wú)差異（P＞0.05）。

9、>　　(7)NQO1的表達(dá):H2O2損傷后，Srxn1干擾組的NQO1 mRNA表達(dá)水平較損傷前升高（0.827 vs.0.557），未轉(zhuǎn)染組(0.868 vs.0.547)與陰性載體組(0.915 vs.0.566)同樣升高，但損傷后Srxn1干擾組較未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組明顯降低(P＜0.05)，而未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組比較無(wú)差異(P＞0.05)。H2O2損傷后Srxn1干擾組的NQO1蛋白水平與未轉(zhuǎn)染組與陰性載體組相比明顯較低(P＜0