微小RNA-208b在糖尿病性心肌纖維化中的作用研究.pdf

1、糖尿病性心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者常見(jiàn)的心血管并發(fā)癥,它獨(dú)立于高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其他心臟病變的心肌疾病。心肌纖維化(Myocardial fibrosis,MF)是引發(fā)DCM的最主要原因之一,而糖尿病性心肌纖維化(Diabetic myocardial fibrosis)的發(fā)生機(jī)制尚不明確。近年來(lái),微小RNA(microRNA,miRNA)在基因表達(dá)調(diào)

2、控中的作用越來(lái)越引起人們的重視。miRNA廣泛存在于動(dòng)植物中,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、形態(tài)建成以及一系列疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。已有研究顯示,miRNAs參與了心肌纖維化的過(guò)程。本文將對(duì)糖尿病性心肌中miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析,篩選表達(dá)變化顯著的miRNAs,研究其在糖尿病性心肌纖維化中的可能作用,為進(jìn)行基于microRNAs的心肌纖維化治療研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的：利用II型糖尿病db/db小鼠和db/m對(duì)照小鼠,

3、新生乳C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞,檢測(cè)db/db和db/m小鼠心肌組織中miRNA表達(dá)譜變化,篩選顯著上調(diào)的miRNA做進(jìn)一步功能研究,試圖揭示其在糖尿病性心肌纖維中的作用機(jī)制。
　　方法：(1)利用16周齡雄性II型糖尿病模型db/db小鼠和db/m對(duì)照小鼠,檢測(cè)外周血血糖和胰島素水平,進(jìn)行葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn),利用小動(dòng)物B超檢測(cè)其心臟結(jié)構(gòu)和功能狀況。
　　(2)利用miRNAs表達(dá)譜芯片,檢測(cè)db/db及db/m小

4、鼠心肌組織中miRNAs表達(dá)變化,利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)鑒定差異表達(dá)的miRNAs。
　　(3)利用差速貼壁法分離出生1d~3d的乳C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞,利用傳至第3代的心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　(4)利用Masson染色、qPCR、Western blot等方法檢測(cè)心肌組織中膠原水平及纖維化相關(guān)基因Col1a1、Col3a1、TGF-β1、CTGF、α-SMA等的表達(dá)。
　

5、　(5)利用AngⅡ、TGF-β1和高糖/葡萄糖氧化酶(G/GO)處理心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞,檢測(cè)miR-208b的表達(dá)變化。
　　(6)分別利用miR-208b模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞,用qPCR、Western blot方法檢測(cè)纖維化相關(guān)基因Col1a1、Col3a1、α-SMA等的表達(dá)。
　　(7)分別利用雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-208b與候選靶基因Mtf2、Pgrm

6、c1的3’UTR的結(jié)合能力。對(duì)比miR-208b mimic,研究Mtf2 siRNA、Pgrmc1 siRNA修飾的小鼠心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　(8)研究調(diào)控糖尿病條件下小鼠心肌成纖維細(xì)胞中miR-208b表達(dá)的信號(hào)通路。
　　結(jié)果：(1)小動(dòng)物心臟B超結(jié)果顯示,對(duì)比db/m小鼠,db/db小鼠心臟左室出現(xiàn)收縮、舒張功能障礙和心室結(jié)構(gòu)改變。
　　(2)Masson染色結(jié)果顯示,db/db小鼠心

7、肌細(xì)胞間質(zhì)和微血管周圍膠原沉積顯著增加,db/db小鼠心肌中Col1a1、Col3a1、CTGF等纖維化相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　(3)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),磷酸化Smad3水平在db/db小鼠心肌組織中顯著升高,Smad3信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。
　　(4)microRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,對(duì)照db/m小鼠,db/db小鼠心肌中多個(gè)miRNAs出現(xiàn)差異性表達(dá),經(jīng)qPCR驗(yàn)證,其中明顯下調(diào)的miRNA有l(wèi)et

8、-7g、miR-142、miR-29b、miR-30e等,而miR-208b在db/db小鼠心肌組織中表達(dá)升高最顯著。
　　(5)在細(xì)胞水平,利用AngⅡ、TGF-β1和高糖/葡萄糖氧化酶(G/GO)處理小鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miR-208b表達(dá)均呈劑量依賴性升高。
　　(6)采用miR-208b mimic處理乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miR-208b可特異上調(diào)Col1a1、α-SMA及CTGF的表達(dá)。

9、　　(7)雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明,miR-208b可抑制候選靶基因Mtf2和Pgrmc1的表達(dá)。利用siRNA分別沉默心肌成纖維細(xì)胞中Mtf2和Pgrmc1表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)纖維化相關(guān)基因表達(dá)增加,與miR-208b mimic作用效果一致。
　　(8)AngⅡ、TGF-β1可激活心肌成纖維細(xì)胞中Smad3信號(hào)通路上調(diào)miR-208b表達(dá),而抑制Smad3可降低miR-208b表達(dá)。
　　結(jié)論：(1)發(fā)生纖維化的16周齡糖

10、尿病db/db小鼠心肌中出現(xiàn)miRNAs的差異性表達(dá)變化。miR-208b在db/db小鼠心肌中表達(dá)顯著升高,而在細(xì)胞水平上,AngⅡ、TGF-β1和G/GO均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞中miR-208b表達(dá)升高。
　　(2)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)證實(shí),miR-208b mimic可特異上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞中Col1a1、Col3a1、CTGF等纖維化相關(guān)基因的表達(dá),而miR-208b inhibitor的