水稻胞質6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因的功能分析.pdf

1、磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway,PPP)與植物的生長發(fā)育及多種脅迫應答相關,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH,EC1.1.1.44)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phophate dehydrogenase,G6PDHEC1.1.1.49)是PPP途徑的兩個關鍵酶。植物細胞中的6PGDH與G6PDH均可分成胞質與質體兩種

2、類型。6PGDH酶催化PPP途徑的第三步反應,將6-磷酸葡萄糖酸脫氫后生成5磷酸核酮糖CO2,同時伴隨NADP+的還原,此反應是不可逆的。本實驗室研究表明,水稻胞質6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因Os6PGDH1在水稻幼苗中的表達受高鹽、低溫、干旱和ABA等不同程度誘導,在非生物脅迫下水稻幼苗中6PGDH的酶活性顯著增強,Os6PGDH1可能參與并調節(jié)水稻對非生物脅迫的應答。 為了研究Os6PGDH1基因的功能,以已公布的Os6PGD

3、H1(GenBank 注冊號：AF486280)cDNA序列為探針,利用BLAST軟件搜索水稻基因組數(shù)據(jù)庫,設計引物,經(jīng)RT-PCR克隆獲得了Os6PGDH1基因的完整ORF。構建原核表達載體pET30(+)-Os6PGDH1,轉化大腸桿菌BL21細胞,通過IPTG誘導外源基因表達,并測定了重組細菌總蛋白的相對酶活性,證明編碼融合蛋白的重組質粒(pET30a(+)-Os6PGDH1)細菌在經(jīng)過IPTG誘導表達后,細菌總蛋白的相對酶活性比

4、含有空載體pET30a(+)細菌的相對酶活性高40.06％,初步證明Os6PGDH1基因是一個編碼6PGDH的功能基因。構建了瞬時表達載體pBI121-Os6PGDH1-GUS,采用農桿菌介導法轉化洋蔥表皮細胞,結果表明Os6PGDH1定位于洋蔥表皮細胞的胞質中。構建植物表達載體pBI121-Os6PGDH1,通過農桿菌介導葉盤轉化法將Os6PGDH1轉化到野生型煙草,經(jīng)卡那霉素抗性篩選、PCR和RT-PCR檢測,獲得了轉Os6PGDH