小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及促腎上腺皮質(zhì)激素的影響.pdf

1、目的:
　　研究小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMMSCs)成骨分化的機(jī)理及促腎上腺皮質(zhì)激素(AdrenocorticotropicHormone,ACTH)對(duì)其成骨分化作用的影響。
　　方法:
　　1.取小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)D1細(xì)胞系，作為研究對(duì)象。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:
　　第一部分:小鼠BMMSCs成骨分化-實(shí)驗(yàn)分組
　　第1組:對(duì)

2、照組1:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第2組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA10ug/ml)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第3組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid,AA50ug/ml)+100μg/m

3、l青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第4組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第5組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA10ug/ml)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)+100

4、μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S);
　　第6組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid,AA50ug/ml)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第7組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+1

5、00μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第8組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid,AA10ug/ml)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第9組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+抗

6、壞血酸鈉（AscorbicAcid，AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)
　　第10組:對(duì)照組2:標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液(低糖細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉（AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)，BM組）
　　第11組:對(duì)照組2+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)，成骨OM組
　　第12組:對(duì)照

7、組2+p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑
　　第13組:成骨OM組（β-gp10mM）+p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑
　　第14組:對(duì)照組2+JNK氨基末端蛋白激酶抑制劑
　　第15組:成骨OM組(β-gp10mM)+JNK氨基末端蛋白蛋白激酶抑制劑
　　第16組:對(duì)照組2+AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑
　　第17組:成骨OM組（β-gp10mM）+AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑
　　第二部分

8、:促腎上腺皮質(zhì)激素對(duì)小鼠BMMSCs成骨分化的影響-實(shí)驗(yàn)分組
　　第1組:對(duì)照組:標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液(低糖細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+抗壞血酸鈉(AA50ug/ml)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素(P/S)，BM組）
　　第2組:對(duì)照組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)
　　第3組:對(duì)照組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-9M)
　　第4組:對(duì)照組+β-甘油磷酸鹽(β-glycerop

9、hosphate，β-gp10mM)，成骨OM組
　　第5組:成骨OM組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)
　　第6組:成骨OM組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-9M)
　　3.礦化染色:培養(yǎng)小鼠BMMSCs6-7天后，通過(guò)ArlizarinRed(茜素紅)染色法評(píng)價(jià)小鼠BMMSCs骨化程度
　　4.基因表達(dá):培養(yǎng)小鼠BMMSCs1天、3天、6天，然后萃取不同時(shí)間細(xì)胞中的RNA，然后采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR

10、技術(shù)，定量分析成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平及ACTH對(duì)其相關(guān)基因水平表達(dá)的影響。
　　5.蛋白質(zhì)水平:培養(yǎng)小鼠BMMSCs15分鐘和60分鐘，萃取不同時(shí)間細(xì)胞中的蛋白質(zhì)成分，采用蛋白印跡(WesternBlotting)技術(shù)，分析成骨分化相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;在加有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)的成骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)小鼠BMMSCs3天和6天后，萃取不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)成分，采用蛋白印跡(WesternBlotting)技術(shù)

11、，分析促腎上腺皮質(zhì)激素對(duì)其成骨分化相關(guān)基因蛋白質(zhì)水平表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠BMMSCs成骨分化:培養(yǎng)細(xì)胞6-7天后，AlizarinRed(茜素紅)染色結(jié)果顯示:第6組:抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)骨化程度高于第5組抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA10ug/ml)+β-甘油磷酸鹽(β-glycer

12、ophosphate,β-gp10mM)和第4組β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)不添加抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA)，說(shuō)明抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA)在小鼠BMMSCs成骨分化過(guò)程中有促進(jìn)的礦化的作用，同時(shí)第6組抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)礦化程度明顯高于第7組β-

13、甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)不添加抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA)和第9組β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM)+抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)，說(shuō)明β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)在成骨分化過(guò)程中對(duì)成骨的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp1mM

14、);由第10組到第17組結(jié)果顯示:JNK氨基末端蛋白激酶抑制劑和AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑促進(jìn)成骨分化，p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑抑制成骨分化;在相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)成骨的組中15分鐘，60分鐘的Runx2，p-p38，BSP,p-AKT的表達(dá)有明顯的改變。
　　2.促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)對(duì)小鼠BMMSCs成骨分化的影響:促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)對(duì)礦化有明顯的抑制作用，而促腎上腺皮質(zhì)激素(AC

15、TH10-9M)對(duì)礦化作用影響不明顯;促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)對(duì)成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受體(MC3R)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFa)的表達(dá)水平具有抑制作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-9M)對(duì)成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受體(MC3R)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFa)的表達(dá)水平作用不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在加有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)的組中，Runx2、BSP

16、和P-P38的蛋白質(zhì)表達(dá)水平有下降的趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　1.在小鼠BMMSCs成骨分化過(guò)程中，抗壞血酸鈉(AscorbicAcid，AA50ug/ml)和β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-gp10mM)有促進(jìn)成骨分化作用，包括促進(jìn)礦化和在基因水平和蛋白水平對(duì)成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2有明顯的促進(jìn)作用。
　　2.促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)對(duì)小鼠BMMSCs成骨分化有抑制作用，而且