趨化因子CCL24-CCR3在人早孕期母-胎界面的表達及調(diào)節(jié)功能.pdf

1、趨化因子是一組有趨化功能的可溶性細(xì)胞因子，通常由70-90個氨基酸組成。通過與細(xì)胞膜上相應(yīng)的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合，趨化因子在淋巴細(xì)胞的募集和活化等免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。到目前為止，在人體已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約50種趨化因子以及相應(yīng)的約18種趨化因子受體。依據(jù)其結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基位點的不同，趨化因子被分為CXCL、CCL、C和CX3C四大亞家族。趨化因子CCL24屬于嗜酸性粒細(xì)胞選擇性趨化和激活因子eotaxins類分子，也被稱為eotax

2、in2或MPIF-2（myeloid progenitor inhibitory factor2）。CCL24與唯一受體CCR3結(jié)合后，在人體廣泛參與過敏性疾病、寄生蟲感染、系統(tǒng)性疾病等多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)病過程。既往研究表明，人早孕期母胎界面存在eotaxins家族的eotaxin1/CCL11分子，并且高表達eotaxins類分子的共同受體CCR3。因此，我們推測:人早孕期母胎界面表達有趨化因子CCL24，CCL24與受體CCR3結(jié)

3、合可能參與子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚胎種植以及母胎免疫耐過程的形成，并發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。本課題圍繞母胎界面局部CCL24和CCR3的表達和功能調(diào)節(jié)進行試驗設(shè)計，以探討趨化因子CCL24和受體CCR3在母胎界面的表達特征及生物學(xué)意義。
　　第一部分CCL24對人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞自分泌調(diào)節(jié)作用
　　目的: 測定CCL24及其受體CCR3在人早孕期絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞(Tros，trophoblasts)上的分子表達水平，并探討CCL24/CCR

4、3對滋養(yǎng)細(xì)胞的自分泌調(diào)節(jié)作用。
　　方法: 分離、培養(yǎng)并鑒定人早孕期母胎界面Tros。免疫組織化學(xué)(IHC，Immunohistochemistry)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA，Enzyme-linkedimmunosorbent assay)及流式細(xì)胞術(shù)(FCM，flow cytometry)測定滋養(yǎng)細(xì)胞分泌或表達CCL24/CCR3的水平。將蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(DSCs，decidual stromal cells)與Tros細(xì)

5、胞共培養(yǎng)48 h，檢測Tros分泌CCL24以及表達CCR3水平的變化。在體外，rhCCL24處理Tros48 h后，BrdU增殖實驗檢測Tros細(xì)胞增殖情況，MTT比色法檢測Tros細(xì)胞活力，侵襲實驗了解Tros細(xì)胞侵襲力的變化。
　　結(jié)果: 本實驗室建立的滋養(yǎng)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，可得到CK7+ Tros細(xì)胞純度達85％。IHC結(jié)果顯示，絨毛組織表達中等水平的CCL24，并高表達CCR3受體。ELISA檢測Tros細(xì)胞體外培養(yǎng)24

6、-96 h不同時段的上清，我們發(fā)現(xiàn)Tros細(xì)胞上清中存在CCL24蛋白，其含量隨時間增加而降低。FCM檢測Tros細(xì)胞膜上CCR3表達水平為(10.79±0.82)％。等比例DSCs與Tros共培養(yǎng)48 h后，CK7+ Tros占總細(xì)胞數(shù)的(21.33±4.21)％。共培養(yǎng)上清中CCL24分泌的水平增加，結(jié)果有顯著差異。共培養(yǎng)后，Tros細(xì)胞表面的CCR3表達水平也明顯增加，至(57.15±11.27)％。在體外，rhCCL24促進Tr

7、os細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活力，并以1 ng/ml效果最明顯。另外，rhCCL24呈劑量依賴性抑制Tros的侵襲能力，高濃度時抑制作用最顯著。
　　結(jié)論: 本課題的原代滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法能得到較高純度的Tros細(xì)胞。人早孕期母胎界面的Tros細(xì)胞可分泌趨化因子CCL24，并表達其受體CCR3，提示在母胎界面CCL24/CCR3可能通過自分泌方式調(diào)解自身的生物學(xué)功能，從而參與胚胎種植和胎盤形成過程。Tros與DSCs共培養(yǎng)，可模擬母胎界面T

8、ros與DSCs直接接觸狀態(tài)。共培養(yǎng)系統(tǒng)中CCL24的分泌水平增加，DSCs能促進Tros細(xì)胞膜上CCR3的表達。CCL24促進Tros細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力，利于胚胎種植和胎盤形成。同時，CCL24又抑制Tros細(xì)胞侵襲能力，控制滋養(yǎng)細(xì)胞侵入過度引起滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病。因此，CCL24在胚胎種植過程中可調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵入蛻膜的程度，從而發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分滋養(yǎng)細(xì)胞來源的CCL24對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞旁分泌調(diào)節(jié)作用
　　目的:

9、 測定CCL24/CCR3在人早孕期DSCs上的分子表達水平，并探討其對DSCs細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)。
　　方法: 分離、培養(yǎng)并鑒定人早孕期母胎界面DSCs細(xì)胞。IHC、ELISA及FCM測定DSCs細(xì)胞分泌或表達CCL24/CCR3的水平。將DSCs與Tros細(xì)胞共培養(yǎng)48h，F(xiàn)CM檢測DSCs細(xì)胞表面CCR3的分子表達水平。在體外，分別用雌二醇(E，estradiol)、孕酮(P，progesterone)和人絨毛膜促性腺素(

10、HCG，humanchorionic gonadotropin)處理DSCs48 h，F(xiàn)CM檢測其表面CCR3的表達情況。在體外，rhCCL24處理DSCs48h后，BrdU增殖實驗檢測DSCs細(xì)胞增殖，AnnexinⅤ/PI法測定DSCs細(xì)胞凋亡，并通過細(xì)胞計數(shù)判斷rhCCL24對DSCs細(xì)胞數(shù)目的影響。
　　結(jié)果: 按已建立的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，得到DSCs細(xì)胞純度高達98％。IHC結(jié)果顯示，蛻膜組織低表達或不表達CCL

11、24，卻高表達CCR3受體。ELISA檢測DSCs細(xì)胞體外培養(yǎng)24-96 h不同時段的上清，均不能測及CCL24分子。FCM檢測DSCs細(xì)胞膜上CCR3分子表達水平為(12.89±6.3)％。DSCs與Tros等比例共培養(yǎng)48 h后， DSCs細(xì)胞表面的CCR3表達水平明顯增加，為(33.87±0.60)％。不同濃度E、P和HCG處理DSCs48 h后，DSCs細(xì)胞表面的CCR3表達水平均增加。高濃度E和P使CCR3表達增加，而HCG對

12、CCR3表達水平的促進作用呈劑量依耐性遞減。在體外，rhCCL24既促進DSCs增殖，又劑量依賴性促進其凋亡。細(xì)胞計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，rhCCL24總體上促進數(shù)量增加，并以10 ng/ml效果最明顯。rhCCL24對DSCs細(xì)胞的促增殖、凋亡和細(xì)胞數(shù)量增加的作用均能被CCL24中和性抗體(α-CCL24)和CCR3中和性抗體(α-CCR3)所抑制。
　　結(jié)論: 原代蛻膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法能得到高純度的DSCs細(xì)胞。人早孕期母胎界面DSCs細(xì)

13、胞不分泌趨化因子CCL24，但能表達高水平CCR3受體，提示滋養(yǎng)細(xì)胞來源的CCL24與DSCs細(xì)胞上CCR3結(jié)合后，可能通過旁分泌方式調(diào)解DSCs細(xì)胞功能，從而參與蛻膜化過程。Tros與DSCs共培養(yǎng)后，DSCs細(xì)胞膜上CCR3的表達增加，說明母胎界面Tros與DSCs直接接觸狀態(tài)有利于CCL24/CCR3對DSCs細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。體外試驗中，E、P和HCG促進DSCs細(xì)胞膜表面CCR3分子表達增加，提示人早孕期高妊娠激素水平也可通過影

14、響DSCs上CCR3的表達水平來調(diào)節(jié)DSCs的生物學(xué)功能。在體外，CCL24既促進DSCs細(xì)胞增殖，也促進其凋亡。總體上，CCL24對DSC s細(xì)胞以促進數(shù)量增加為主，從而可能促進蛻膜化過程。
　　第三部分 CCL24對人早孕期蛻膜γδT細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用
　　目的: 檢測人早孕期蛻膜免疫細(xì)胞（DICs，decidual immunal cells）的組成及各細(xì)胞表面CCR3表達水平;測定γδT細(xì)胞上共刺激分子、增殖和凋亡相關(guān)

15、分子的表達，并了解CCL24/CCR3對γδT細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)作用。
　　方法: 原代分離、培養(yǎng)人早孕期母胎界面DICs細(xì)胞，F(xiàn)CM測定DICs中各細(xì)胞比例以及CCR3的表達水平。分離純化γδT細(xì)胞，F(xiàn)CM測定其表面共刺激分子的表達水平;體外rhCCL24處理γδT細(xì)胞48 h后，F(xiàn)CM檢測共刺激分子表達情況。FCM檢測γδ T細(xì)胞增殖和凋亡分子的表達水平;體外rhCCL24處理γδT細(xì)胞48 h后，F(xiàn)CM檢測增殖和凋亡相關(guān)分子的表

16、達情況。
　　結(jié)果: DICs主要由CD3-CD56+ NK細(xì)胞組成，約占60％;CD14標(biāo)記的巨噬細(xì)胞Mψ細(xì)胞和CD3+的T淋巴細(xì)胞分別占10-20％;另外，DICs中還存在少量的DC細(xì)胞。DICs中各細(xì)胞組分均表達CCR3分子，T細(xì)胞上CCR3水平最高，約為90％;γδ T細(xì)胞表面CCR3水平為(87.57±7.99)％。原代分離CD3+γδTCR+的γδT細(xì)胞純度約為90％。測定的9種共刺激分子中，ICOS、GITR、CD

17、40L和NKG2D表達水平較高，OX-40和PD-1中等水平表達，而CTLA-4、CD28和NKG2A表達水平較低。rhCCL24和Tros培養(yǎng)上清抑制γδT細(xì)胞表面ICOS、GITR和PD-1的表達水平，而Tros培養(yǎng)上清中加入α-CCL24或α-CCR3后，降調(diào)節(jié)作用被抑制。rhCCL24和Tros培養(yǎng)上清對γδT細(xì)胞表面的CD40L、NKG2D及OX-40表達的調(diào)節(jié)作用不明顯。γδT細(xì)胞中等程度表達細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原Ki67、細(xì)胞

18、凋亡控制蛋白Bcl2和細(xì)胞凋亡膜表面分子Fas，細(xì)胞膜表面FasL表達水平低。rhCCL24或Tros培養(yǎng)上清處理γδT細(xì)胞48 h，均能抑制γδT細(xì)胞胞內(nèi)Ki67和Bcl2表達水平，但對膜表面Fas蛋白表達的調(diào)節(jié)作用不明顯。當(dāng)Tros培養(yǎng)上清中加入α-CCL24或α-CCR3時，上清對Ki67和Bcl2表達的抑制作用部分恢復(fù)。
　　結(jié)論: DICs主要由NK細(xì)胞、T細(xì)胞、Mψ細(xì)胞以及少量DC細(xì)胞組成。DICs中各細(xì)胞組分均表達

19、CCR3分子，γδ T細(xì)胞表面CCR3水平較高，提示CCL24可能調(diào)節(jié)DICs生物學(xué)功能，尤其參與對γδ T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。原代細(xì)胞培養(yǎng)能得到較高純度的γδ T細(xì)胞。γδ T細(xì)胞表面表達多種共刺激因子，如ICOS、GITR、CD40L、NKG2D、OX-40和PD-1。CCL24降調(diào)節(jié)GITR、ICOS和PD-1的表達;因此，CCL24可能通過抑制γδ T細(xì)胞表面共刺激因子的表達水平而調(diào)控其活化。CCL24抑制蛻膜γδ T細(xì)胞增殖，可能