卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)蛋白的比較蛋白質(zhì)組學分析及耐藥相關(guān)蛋白Annexin A3功能的研究.pdf

1、研究背景： 卵巢癌是婦科腫瘤首位致死性疾病，晚期患者的5年生存率始終徘徊在15％～20％，腫瘤細胞對于化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成這一狀況的主要原因之一。鉑類是治療卵巢癌的一線化療藥物，臨床卵巢癌對于鉑類藥物耐藥已有明確的認識和定義。然而，有關(guān)鉑類耐藥機制的闡明卻遠遠不足。目前從基因水平對于腫瘤耐藥機制的認識已經(jīng)相對深入，但多數(shù)研究的結(jié)果表明，多種耐藥相關(guān)基因在卵巢癌中的表達并不能良好地預測腫瘤的耐藥和預后，mRNA的豐度與其相應的

2、蛋白質(zhì)水平的表達具有不一致性可能是主要的原因之一。蛋白質(zhì)組學技術(shù)為從蛋白質(zhì)表達水平深入研究耐藥基因的功能提供了可能性。 蛋白質(zhì)組學技術(shù)是一項新興的實驗技術(shù)，廣泛應用于生物學研究的各個領(lǐng)域。總體上看，該項研究技術(shù)主要包含以下幾個內(nèi)容：1.表達蛋白質(zhì)組學；2.功能蛋白質(zhì)組學；3.結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學。目前，蛋白質(zhì)組學技術(shù)在卵巢腫瘤研究中的應用主要集中于卵巢癌的早期診斷和篩選腫瘤標志物等方面。從臨床組織入手直接研究鉑類耐藥機制，存在異質(zhì)性、

3、影響因素復雜、陽性結(jié)果易丟失等諸多困難。因此，以細胞系為研究對象，逐步延伸到臨床成為迄今研究耐藥機制的主要方法之一。 本研究旨在采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)尋找卵巢癌耐藥相關(guān)候選蛋白。在誘導獲得分別耐受順鉑和卡鉑的人卵巢上皮癌細胞系SKOV3和A2780的基礎上，首次采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，對多個鉑類敏感和耐藥的細胞系進行比較蛋白質(zhì)組分析，尋找耐藥相關(guān)的差異表達蛋白。通過對候選蛋白的生物學和功能鑒定確認其與鉑類耐藥的相關(guān)性，并在臨床組織學標本

4、中得到驗證。進一步對耐藥相關(guān)候選蛋白導致細胞對鉑類耐藥的機制進行探討。 研究方法： 1.分別采用順鉑大劑量沖擊和小劑量間歇誘導法誘導卵巢上皮癌鉑類敏感細胞系SKOV3，建立順鉑耐藥細胞系SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80。獲得卵巢上皮癌鉑類敏感及分別耐順鉑和卡鉑細胞系A2780，以及SKOV3耐卡鉑細胞系。分別檢測上述細胞的生物學特性、耐藥性、以及部分耐藥相關(guān)基因的表達。 2．分別提取上述各株鉑

5、類敏感及耐藥細胞系的總蛋白質(zhì)。采用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)，考馬斯亮藍染色，圖像分析軟件分析，實驗重復3次，識別差異表達蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶切，基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定蛋白質(zhì)。定量PCR、Western blot法分別驗證耐藥相關(guān)候選蛋白在各細胞系中mRNA水平、蛋白質(zhì)水平的表達。 3.利用基因工程技術(shù)，分別構(gòu)建表達正義及反義耐藥相關(guān)候選蛋白的真核表達質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體介導質(zhì)粒DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各

6、細胞系，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，檢測轉(zhuǎn)染前后細胞的生物學特性和耐藥性的改變。 4.分別將親本和轉(zhuǎn)染了正義耐藥相關(guān)候選蛋白質(zhì)粒的SKOV3細胞接種裸鼠體內(nèi)，比較順鉑腹腔化療對動物體內(nèi)成瘤性的影響。 5.采用免疫組化的方法，分別檢測臨床卵巢癌對鉑類化療敏感(n=21)和耐藥(n=21)患者的病理切片中耐藥相關(guān)候選蛋白的表達。利用等級資料的秩和檢驗，分析化療敏感及耐藥患者候選蛋白表達量的差異。采用log-rank檢驗分析

7、候選蛋白的表達與腫瘤無瘤生存期的關(guān)系。 6．耐藥機制的研究方法包括，MTT法檢測轉(zhuǎn)染細胞對紫杉醇、表阿霉素的IC50和RI，以驗證耐藥相關(guān)候選蛋白的特異性。通過免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察耐藥相關(guān)候選蛋白在細胞內(nèi)的定位。采用電感偶合等離子質(zhì)譜檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的鉑含量和鉑-DNA的結(jié)合量。以Western blot法觀察轉(zhuǎn)染細胞的p53變化。利用超濾法濃縮細胞培養(yǎng)上清后，Western blot法檢測細胞外耐藥相關(guān)候選蛋白的表

8、達。 研究結(jié)果： 1.歷時16個月誘導卵巢癌順鉑耐藥細胞，SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的耐藥指數(shù)分別為4.1±2.0和11.5±3.2，小劑量間歇誘導法的耐藥指數(shù)高于大劑量沖擊誘導法。SKOV3/CDDP-80細胞的形態(tài)、生長和耐藥基因的表達均較SKOV3和SKOV3/CDDP-P有明顯不同。SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP的耐藥指數(shù)分別為3.0±0.2、3.5±0.8

9、、3.5±0.7。在實驗過程中所有耐藥細胞的IC50和砌RI無明顯改變，耐藥性很穩(wěn)定。 2.發(fā)現(xiàn)卵巢癌耐藥細胞系與其親本細胞共有62個差異表達蛋白質(zhì)點，利用MALDI-TOF-MS成功的鑒定了57個蛋白質(zhì)點。它們的功能分別與能量代謝、核苷酸代謝、氧化還原作用、分子伴侶、信號轉(zhuǎn)導、細胞骨架調(diào)節(jié)等相關(guān)。其中5種蛋白質(zhì)(Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin 1)在三種以上耐藥細胞中均差異表達。

10、Annexin A3和Destrin在全部耐藥標本中表達均上調(diào)，IDHc在四種耐藥細胞中均下調(diào)；GST-omega 1除了在SKOV3/CBP中表達無改變外，在其余三種細胞中均表達上調(diào)；而Cofilin 1在SKOV3的兩種耐藥細胞中表達下調(diào)，在A2780的耐藥細胞中卻皆上調(diào)。 3.在上述五種共表達的差異候選蛋白質(zhì)中，Annexin A3蛋白的表達量差異最為顯著，在耐藥細胞中上調(diào)了3～20倍。經(jīng)過定量PCR、Western bl

11、ot法驗證，Annexin A3的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平與比較蛋白質(zhì)組分析獲得了一致的結(jié)果，從而被最終確定為本研究的耐藥相關(guān)候選蛋白。 4.將正義Annexin.A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鉑類敏感的細胞系后，耐藥指數(shù)上升2~4倍，生長和增殖受到抑制。將反義Annexin A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鉑類耐藥的細胞系后，耐藥指數(shù)下降2倍左右，生長和增殖加快。細胞形態(tài)均無明顯改變。 5.裸鼠成瘤實驗的結(jié)果表明，給予順鉑化療后，與親本的SKOV3細胞相比

12、，轉(zhuǎn)染正義Annexin A3質(zhì)粒的細胞移植瘤生長減慢，成瘤體積縮小，抑瘤率明顯降低。至觀察結(jié)束時，SKOV3組移植瘤抑瘤率為(76.9±22.5)％，而SA4組移植瘤抑瘤率為(28.5±13.7)％，兩組有統(tǒng)計學差異(P=0.002)。 6.免疫組化染色比較化療敏感及耐藥患者腫瘤標本中的Annexin A3表達量，U值=139，P值=0.035，具有明顯差異，Annexin A3在化療耐藥患者中的表達量明顯增高。比較無瘤生存期

13、，Annexin A3高表達患者平均11.3月(95％可信區(qū)間=4.0~18.0月)；Annexin A3低表達者平均16.0月(95％可信區(qū)間=5.9~26.1月)；二者具有顯著性差別(P值=0.012)。 7.轉(zhuǎn)染正義或反義Annexin A3質(zhì)粒的細胞對紫杉醇和表阿霉素的耐藥性均無明顯改變。在細胞漿和細胞核中均可檢測到Annexin A3的表達。在Annexin A3過表達的細胞，胞漿內(nèi)鉑濃度明顯降低，與DNA結(jié)合的鉑明顯

14、減少，鉑的排出率明顯升高；經(jīng)CDDP作用后p53表達的增幅較小。在Annexin A3低表達的細胞，胞漿內(nèi)和與DNA結(jié)合的鉑濃度均明顯升高，CDDP作用后p53表達的增幅較大。Annexin A3可被分泌到細胞外，其分泌量隨著細胞內(nèi)Annexin A3表達的升高而增加；經(jīng)CDDP作用后可觀察到分泌量的增加。 結(jié)論： 1.兩種方式誘導卵巢上皮癌細胞系SKOV3均可獲得穩(wěn)定的鉑類耐藥細胞系。大劑量沖擊誘導方式模擬臨床的化療過

15、程，但耐藥性的產(chǎn)生低于小劑量間歇誘導法，其耐藥指數(shù)可能更接近于機體內(nèi)情況。SKOV3細胞對鉑類耐藥性的產(chǎn)生與已知鉑類耐藥相關(guān)基因的表達不具有明顯的一致性。 2. 2-DE結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)可以有效地識別和鑒定卵巢癌化療敏感和耐藥細胞系之間差異表達的蛋白質(zhì)。本研究共發(fā)現(xiàn)Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin 1等五種在三株以上耐藥細胞中差異表達的蛋白質(zhì)，其功能涉及到多種生理代謝

16、和調(diào)節(jié)過程，提示卵巢癌對于鉑類耐藥是多方面多途徑的。 3. Annexin A3蛋白在上述五種耐藥相關(guān)候選蛋白中以其在全部耐藥細胞系中的共表達、上調(diào)幅度明顯、同時獲得了mRNA和蛋白質(zhì)表達水平的驗證，被確定為本研究的目標耐藥候選蛋白。 4.采用基因工程技術(shù)分別將正義或反義Annexin A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鉑類敏感和耐藥細胞后，觀察到細胞對鉑類耐藥性的相應增加或減小，驗證了Annexin A3蛋白與鉑類耐藥的相關(guān)性。 5

17、.動物體內(nèi)成瘤實驗將轉(zhuǎn)染了正義Annexin A3質(zhì)粒的SKOV3細胞接種裸鼠體內(nèi)后，與親本細胞組相比，腫瘤生長減慢，成瘤體積縮小，移植瘤抑制率明顯降低，表明Annexin A3在動物體內(nèi)仍能發(fā)揮其耐順鉑的作用。 6.免疫組化染色的結(jié)果顯示，Annexin A3在臨床化療耐藥患者中的表達量明顯增高；Annexin A3高表達患者的無瘤生存期明顯低于低表達者；從而在人體進一步驗證了Annexin A3是一種鉑類耐藥相關(guān)蛋白。

18、 7.轉(zhuǎn)染正義Annexin A3質(zhì)粒的卵巢癌細胞對于順鉑和卡鉑的體外耐藥性均明顯增加，但對于紫杉醇和表阿霉素的耐藥性無明顯改變，提示Annexin A3可能是一種特異的鉑類耐藥相關(guān)蛋白。這一蛋白可以定位于細胞漿和細胞核，其表達增強造成化療時細胞內(nèi)的鉑濃度降低，與DNA相結(jié)合的鉑減少，致使卵巢癌細胞p53活化程度降低，凋亡減少，細胞對于鉑類化療耐受。本研究在細胞外檢測到Annexin A3的表達，為進一步在外周血尋找鉑類耐藥標記物打下