腫瘤浸潤性γδ1T細(xì)胞(γδ1TIL)CDR3δ1區(qū)的序列分析及TCRγδ1 3δ1結(jié)合腫瘤抗原的分子結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、γδT細(xì)胞雖然在整個(gè)T細(xì)胞群體中所占的比例較少,但其作為固有免疫成員在抗感染免疫、腫瘤免疫、免疫調(diào)節(jié)以及自身免疫等方面的作用日益成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。然而,較之αβT細(xì)胞較為清楚的功能和結(jié)構(gòu)研究,免疫學(xué)界對γδT細(xì)胞受體(TCRγδ)識(shí)別抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)所知甚少。而且,與人外周血中γ9δ2TCR識(shí)別腫瘤抗原配體及其識(shí)別腫瘤抗原的分子機(jī)制研究相比,人們對上皮粘膜中的Vδ1的研究明顯不足。
　　 近年來,本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)深入地研究了γ9δ2

2、T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤抗原配體及其識(shí)別的分子機(jī)制,并取得了一些重要的學(xué)術(shù)成果。前期結(jié)果顯示,CDR382的側(cè)翼序列在TCRγ9δ2與腫瘤抗原結(jié)合中起關(guān)鍵作用[1]。
　　 本論文旨在進(jìn)一步探討γδT細(xì)胞中另一大類上皮內(nèi)γδ1T細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用及其識(shí)別腫瘤抗原的分子機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)第一部分工作為腫瘤浸潤性γδ1T細(xì)胞(γδ1TIL)CDR381區(qū)的序列分析。
　　 首先用固相包被抗體,體外擴(kuò)增了14例腫瘤組織(

3、胃癌、腎癌、卵巢癌、膀胱癌、食管癌、肺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤)和2例腫瘤腹水(漿乳癌)的γδ腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltration lymphocytes,γδTIL),培養(yǎng)3～4周后,γδTIL呈優(yōu)勢生長(最高達(dá)98％),主要為δ1亞型。
　　 RT-PCR法擴(kuò)增CDR381基因片段,測序分析其序列特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CDR3δ1區(qū)序列有以下特征:一是γδTIL TCR CDR3δ1確實(shí)存在優(yōu)勢序列；二是不同個(gè)體的同種組織

4、來源的γδTIL的CDR3δ1優(yōu)勢序列趨于相同,但也存在差異；三是不同組織來源的γδTIL的CDR3δ1優(yōu)勢序列不同；四是不同個(gè)體的同種組織來源的γδTIL,的CDR381優(yōu)勢序列相對較短。以上結(jié)果說明,識(shí)別相同組織來源腫瘤的γδTIL的CDR3δ1序列具有有限多樣性,提示相同組織來源的腫瘤的表面抗原也可能具有有限多樣性。因此,我們選取3例胃癌組織共有的CDR3δ1優(yōu)勢序列(GTM)作為后續(xù)有關(guān)結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。
　　 利用人工合

5、成的CDR3δ1(GTM)肽作為探針,Western blot檢測胃癌細(xì)胞系BGC-823總蛋白中的結(jié)合分子,發(fā)現(xiàn)在66～90KD和90KD以上分別有一條染色帶。提示BGC-823總蛋白中可能存在CDR3δ1識(shí)別的蛋白分子。但以GTM肽-親和柱層析分離BGC-823總蛋白,未能成功獲得結(jié)合蛋白分子。
　　 體外擴(kuò)增γδTIL的表型研究結(jié)果顯示,γδTIL高表達(dá)NKG2D、CD8、GranzymeA和TLR8,低表達(dá)或不表達(dá)CD4

6、、GITR、CTLA-4和CD127。一例胃癌W2-γδTIL和一例腎癌S2-γδTIL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,W2-γδTIL和S2-γδTIL均對腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷功能。檢測γδTIL分泌的細(xì)胞因子,結(jié)果顯示所有TIL的IL6分泌水平均較高；γδ1TIL的GM-CSF因子分泌水平明顯高于αβTIL。
　　 本實(shí)驗(yàn)的第二部分工作是探討CDR381各個(gè)結(jié)構(gòu)域在抗原識(shí)別中的作用。主要通過CDR361合成多肽、CDR381移植性TCR

7、以及細(xì)胞膜表達(dá)不同CDR381移植型TCRγδ異質(zhì)二聚體的技術(shù)體系,來研究CDR3δ1與抗原特異性結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 人工合成CDR3δ1(GTM)肽及其V、D、J區(qū)分別隨機(jī)突變肽GTM-Vm、GTM-Dm、GTM-Jm,通過流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦掃描顯微鏡、ELISA、SPR及免疫組化等方法,檢測GTM肽及其突變肽與腫瘤細(xì)胞或組織的結(jié)合。結(jié)果顯示,與GTM肽相比,GTM-Vm和GTM-Jm肽的結(jié)合活性明顯下降,而GTM

8、-Dm肽的結(jié)合活性變化不大,提示保守的CDR3δ1側(cè)翼序列在抗原識(shí)別中起關(guān)鍵作用。
　　 進(jìn)而,通過重組CDR361移植的TCRγ4-Fc/δ1-Fc融合蛋白即γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM)-Fc及其三種突變體融合蛋白γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM-Vm)-Fc、γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM-Dm)-Fc和γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM-Jm)-Fc檢測與腫瘤細(xì)胞或組織的結(jié)合作用。結(jié)果與合成肽所得結(jié)果一致。進(jìn)

9、一步證明TCRγ481與腫瘤抗原的相互作用主要取決于其保守的側(cè)翼序列。
　　 最后,我們將完整的γ4和δ1鏈轉(zhuǎn)染進(jìn)J.RT3-T3.5細(xì)胞,建立膜表達(dá)不同CDR381移植型TCR異質(zhì)二聚體的細(xì)胞,以期在細(xì)胞水平上模擬γδ1TIL識(shí)別腫瘤的分子機(jī)制,檢測CDR381區(qū)不同結(jié)構(gòu)域在腫瘤抗原識(shí)別中的作用。結(jié)果在轉(zhuǎn)染81-CDR3(GTM)-γ4和δ1-CDR3(GTM-Dm)-γ4的細(xì)胞表面用FACS檢測到了γδTCR的表達(dá)；但在轉(zhuǎn)染

10、突變體序列的δ1-CDR3(GTM-Vm)-γ4和δ1-CDR3(GTM-Jm)-γ4的細(xì)胞表面未見γδTCR的表達(dá)。即使改變CDR3區(qū)各區(qū)突變氨基酸(將隨機(jī)突變氨基酸換成丙氨酸),δ1-CDR3(GTM-VAm)-γ4和δ1-CDR3(GTM-JAm)-γ4仍未在轉(zhuǎn)染細(xì)胞膜表達(dá)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。
　　 綜上所述,我們得出以下結(jié)論:
　　 1、優(yōu)化體外腫瘤浸潤性γδT細(xì)胞(γδTIL)的擴(kuò)增培養(yǎng)條件,成功培

11、養(yǎng)16例γδTIL,主要為δ1表型。在體外,擴(kuò)增所獲γδ1TIL對腫瘤細(xì)胞具有殺傷活性。
　　 2、體外擴(kuò)增培養(yǎng)的γδTIL的TCR CDR3δ1序列具有相對優(yōu)勢特征。不同個(gè)體的同種組織來源的γδTIL的CDR3區(qū)優(yōu)勢序列趨于相同。選取3例胃癌來源γδTIL共有的CDR3δ1區(qū)優(yōu)勢序列GTM作為后續(xù)結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。
　　 3、采用隨機(jī)突變的策略,在CDR351短肽水平上、γ4δ1T-Fc融合蛋白水平上,證明CDR3δ1的