TCRγ9-δ2 CDR3δ結(jié)合腫瘤抗原的分子基礎(chǔ)及腫瘤反應(yīng)性TCRγ9-δ2移植的人源化抗體-抗體片段的抗腫瘤作用研究.pdf

1、盡管T細(xì)胞受體(TCR)V82T細(xì)胞僅占外周血T細(xì)胞的2～5％，然而其顯著的抗腫瘤作用卻一直備受關(guān)注。研究表明，Vδ2T細(xì)胞在體內(nèi)外對多種腫瘤細(xì)胞都具有顯著的殺傷活性。近年來，我們實驗室對TCRγ9/82識別的腫瘤抗原配體及其識別腫瘤抗原的分子機制開展了較系統(tǒng)深入的研究，并取得了一些學(xué)術(shù)成果。
　　 本實驗室在前期工作中獲得了一個卵巢癌反應(yīng)性的TCRCDR3δ序列，命名為OT3。通過人工合成的OT3肽與靶細(xì)胞、靶組織的結(jié)合實驗，

2、我們證明了CDR3δ是TCRγ9/δ2與腫瘤抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位。為了闡明CDR3δ與腫痛抗原結(jié)合的分子基礎(chǔ)，曾將OT3肽的V、D和J區(qū)隨機突變，比較了其與突變體與腫瘤抗原結(jié)合的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDR3δ的側(cè)翼序列在TCRγ9/δ2與腫瘤抗原結(jié)合中起關(guān)鍵作用。
　　 本研究第一部分工作為了在三維構(gòu)象水平迸一步驗證這一結(jié)果，我們建立了體外真核表達(dá)1℃Rγ9/δ2-Fc融合蛋白技術(shù)平臺，并表達(dá)了TCRγ9/82(OT3)-Fc及其CDR

3、3δOT3的V、D和J區(qū)隨機突變的三個突變體蛋白γ9/δ2(OT3)Vm-Fc、TCRγ9/δ2(OT3)Dm-Fc和TCRγ9/δ2(OT3)Jm-Fc，從而將CDR38放在一個完整的TCR結(jié)構(gòu)中。在體外，通過流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)、免疫組化和ELISA的方法研究了TCRγ9/δ2(OT3)-Fc及其突變體與腫瘤細(xì)胞、組織和抗原的結(jié)合情況。結(jié)果顯示當(dāng)V區(qū)和J區(qū)突變(Vm和Jm)后，TCRγ9/δ2(OT3)-Fc與腫瘤細(xì)

4、胞和組織的結(jié)合活性明顯下降，而D區(qū)(Dm)突變下降的并不明顯。這一結(jié)果與我們實驗室前期結(jié)果一致。我們進(jìn)一步證實了，CDR3δ的側(cè)翼序列是TCRγ9/δ2與腫瘤抗原結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域這一推論。此外我們建立了利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技術(shù)平臺，并表達(dá)純化了TCRγ9/δ2(OT3)-Fc和其點突變?nèi)诤系鞍譚CRγ9/δ2(OT3)CA-Fc和TCRγ9/δ2(OT3)LA-Fc。通過激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)和EL

5、ISA的方法檢測了各融合蛋白與腫痛細(xì)胞和抗原的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，當(dāng)V區(qū)的半胱氨酸(C)和J區(qū)的亮氨酸(L)突變后，融合蛋白與靶細(xì)胞和靶抗原的結(jié)合活性明顯下降，這一結(jié)果提示我們，V區(qū)的半胱氨酸(C)和J區(qū)的亮氨酸(L)可能為TCRγ9/δ2(OT3)與腫瘤結(jié)合的關(guān)鍵點。
　　 根據(jù)TCRγ9/δ2可以識別多種腫瘤這一特點，結(jié)合目前抗體靶向治療腫瘤所面臨的靶向特異性有待進(jìn)一步揭示的問題，我們提出了一個腫瘤靶向治療的創(chuàng)新性策略:即將

6、人類TCRγδ識別腫瘤的特性通過基因工程的方法移植到一個基因工程抗體中?；谶@一策略，在本研究工作的第二部分，我們根據(jù)不同需要設(shè)計并表達(dá)了三種腫瘤反應(yīng)性TCRγ9/δ2移植的人源化抗體/抗體片段，分別為TCRγ9/δ2(OT3)-Fc、TCRVδ2(OT3)-Fc和TCRVδ2(OT3)H/Vγ9Lλ。通過流式細(xì)胞術(shù)、confocal、免疫組化和ELISA等方法，比較了三種抗體/抗體片段與腫瘤細(xì)胞、組織和蛋白的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，TCR

7、γ9/δ2(OT3)-Fc與腫瘤抗原的結(jié)合活性最強，TCRVδ2(OT3)-Fc次之，TCRVδ2(OT3)H/Vγ9Lλ與腫瘤抗原的結(jié)合活性最弱。繼而，通過放射性同位素標(biāo)記技術(shù)，對TCRγ9/δ2(OT3)-Fc和TCRVδ2(OT3)-Fc進(jìn)行99m1C標(biāo)記，并且觀察了99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc和99mTc-TCRVδ2(OT3)-Fc在荷SKOV3瘤裸鼠體內(nèi)顯像和分布情況。體內(nèi)外的實驗結(jié)果顯示，在這三種抗體/抗體

8、片段中，TCRγ9/δ2(OT3)-Fc抗體片段比較適于腫瘤的靶向治療。最后，我們進(jìn)一步觀察了這種新型移植性抗體片段TCRγ9/δ2(OT3)-Fc抗腫瘤效果。體外實驗顯示，TCRγ9/δ2(OT3)-Fc的加入可以增強中性粒細(xì)胞對SKOV3和Daudi的殺傷作用；SKOV3荷瘤裸鼠治療實驗顯示，與PBS組相比，瘤周注射TCRγ9/δ2(OT3)-Fc組和TCRγ9/δ2(OT3)-Fc加中性粒細(xì)胞組，都明顯抑制腫瘤的生長。綜上，本研究

9、初步論證了TCRγδ移植性抗體用于腫瘤靶向治療的可行性，為腫瘤靶向性抗體治療提供了新的線索和基礎(chǔ)。
　　 綜合兩部分的實驗結(jié)果，可以得到以下結(jié)論:
　　 1.CDR3δ的側(cè)翼序列是TCR與腫瘤抗原結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
　　 2.CDR3δ序列中V區(qū)的半胱氨酸(C)和J區(qū)的亮氨酸(L)可能為TCRγ9/δ2(OT3)結(jié)合腫瘤抗原的關(guān)鍵點。
　　 3.腫瘤反應(yīng)性TCRγ9/δ2(OT3)移植的人源化抗體片段TCR