乳腺癌患者乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血之間T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)的比較.pdf

1、目的：
　　分析和比較乳腺癌患者乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本中的T細(xì)胞TCRβ鏈 CDR3（Complementarity determining region3）受體庫(kù)的組成和特征，初步探討乳腺癌患者T細(xì)胞免疫應(yīng)答的空間異質(zhì)性。
　　方法：
　　12名乳腺癌臨床志愿患者來(lái)源于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲乳外科，具有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期Ⅱ期，篩選標(biāo)準(zhǔn)符合NCCN（美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)）乳腺癌指南和A

2、JCC（美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)）乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，乳腺癌志愿患者遵從患者知情同意原則。
　　2采集2例乳腺癌志愿患者乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及外周血（EDTA-K2抗凝）樣本，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），并提取所有樣本的總 DNA。樣本序列號(hào)命名為患者1（patient1，P1）的乳腺腫瘤組織樣本（P1-1），腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本（P1-2），腋

3、窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本（P1-3），外周血樣本（P1-4），患者2（patient2，P2）的乳腺腫瘤組織樣本（P2-1），腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本（P2-2），腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本（P2-3），外周血樣本（P2-4）。
　　3人T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3建庫(kù)和高通量測(cè)序（High-throughput sequencing，HTS）：Illumina Solexa HTS測(cè)序出各樣本CDR3序列，CDR3受體庫(kù)的制備、測(cè)序和質(zhì)控

4、均由美國(guó)華盛頓醫(yī)學(xué)院Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ完成。
　　4 T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)組成和特征分析：測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)上傳至免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Immunogenetics database，IMGT），根據(jù) IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)HighV-QUEST軟件和VBA編程等，初步分析各樣本T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)的TRBV、TRBJ家族分布及 CDR3區(qū)特征等，序列的分析與儲(chǔ)存在 EX

5、CEL（2010版本）中完成并通過(guò)Graphpad prism5軟件作圖。
　　結(jié)果：
　　12名乳腺癌志愿患者八個(gè)樣本總 DNA在瓊脂糖凝膠電泳預(yù)測(cè)位置出現(xiàn)清晰的條帶，經(jīng)Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ檢測(cè)，八個(gè)樣本總DNA在濃度和總量上均達(dá)到建庫(kù)測(cè)序要求。
　　2各樣本 T細(xì)胞 TCRβ鏈 CDR3受體庫(kù) HTS測(cè)序所得原始序列經(jīng)IMGT/HighV-QUEST分析后結(jié)果如下：P

6、1乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3序列總數(shù)/獨(dú)特序列數(shù)分別為：796056條/8131條，1040216條/5719條，1767820條/31132條，1715292條/14270條；P2乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本 T細(xì)胞 TCRβ鏈 CDR3序列總數(shù)/獨(dú)特序列數(shù)分別為：1556849條/17320條，1673041條/80653條，133

7、5602條/43757條，1472189條/31276條。
　　3 P1和P2乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本表現(xiàn)出不同的TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)克隆，在不同的組織部位存在特異性的TRBV高頻取用。
　　4對(duì)各樣本排名前10的克隆序列分析發(fā)現(xiàn)P1乳腺腫瘤組織和腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)存在相同的優(yōu)勢(shì)配對(duì)TRBV10-3-TRBJ1-5，P2乳腺腫瘤組織和腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)存在相同的優(yōu)勢(shì)配對(duì)TRBV2

8、7-TRBJ1-5，與腋窩無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和外周血不同。
　　5每例患者乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)各個(gè)樣本之間有著不同比例的CDR3重疊。其中，乳腺腫瘤組織與腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)重疊相對(duì)較高，在乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和外周血的重疊序列中，乳腺腫瘤組織高頻表達(dá)的序列在外周血表達(dá)較低。
　　結(jié)論：
　　乳腺癌患者乳腺腫瘤組織、腋