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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
分析和比較乳腺癌患者乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本中的T細(xì)胞TCRβ鏈 CDR3(Complementarity determining region3)受體庫(kù)的組成和特征,初步探討乳腺癌患者T細(xì)胞免疫應(yīng)答的空間異質(zhì)性。
方法:
12名乳腺癌臨床志愿患者來(lái)源于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲乳外科,具有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,臨床分期Ⅱ期,篩選標(biāo)準(zhǔn)符合NCCN(美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò))乳腺癌指南和A
2、JCC(美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì))乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn),乳腺癌志愿患者遵從患者知情同意原則。
2采集2例乳腺癌志愿患者乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及外周血(EDTA-K2抗凝)樣本,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并提取所有樣本的總 DNA。樣本序列號(hào)命名為患者1(patient1,P1)的乳腺腫瘤組織樣本(P1-1),腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本(P1-2),腋
3、窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本(P1-3),外周血樣本(P1-4),患者2(patient2,P2)的乳腺腫瘤組織樣本(P2-1),腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本(P2-2),腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)樣本(P2-3),外周血樣本(P2-4)。
3人T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3建庫(kù)和高通量測(cè)序(High-throughput sequencing,HTS):Illumina Solexa HTS測(cè)序出各樣本CDR3序列,CDR3受體庫(kù)的制備、測(cè)序和質(zhì)控
4、均由美國(guó)華盛頓醫(yī)學(xué)院Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ完成。
4 T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)組成和特征分析:測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)上傳至免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Immunogenetics database,IMGT),根據(jù) IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)HighV-QUEST軟件和VBA編程等,初步分析各樣本T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)的TRBV、TRBJ家族分布及 CDR3區(qū)特征等,序列的分析與儲(chǔ)存在 EX
5、CEL(2010版本)中完成并通過(guò)Graphpad prism5軟件作圖。
結(jié)果:
12名乳腺癌志愿患者八個(gè)樣本總 DNA在瓊脂糖凝膠電泳預(yù)測(cè)位置出現(xiàn)清晰的條帶,經(jīng)Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ檢測(cè),八個(gè)樣本總DNA在濃度和總量上均達(dá)到建庫(kù)測(cè)序要求。
2各樣本 T細(xì)胞 TCRβ鏈 CDR3受體庫(kù) HTS測(cè)序所得原始序列經(jīng)IMGT/HighV-QUEST分析后結(jié)果如下:P
6、1乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3序列總數(shù)/獨(dú)特序列數(shù)分別為:796056條/8131條,1040216條/5719條,1767820條/31132條,1715292條/14270條;P2乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本 T細(xì)胞 TCRβ鏈 CDR3序列總數(shù)/獨(dú)特序列數(shù)分別為:1556849條/17320條,1673041條/80653條,133
7、5602條/43757條,1472189條/31276條。
3 P1和P2乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本表現(xiàn)出不同的TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)克隆,在不同的組織部位存在特異性的TRBV高頻取用。
4對(duì)各樣本排名前10的克隆序列分析發(fā)現(xiàn)P1乳腺腫瘤組織和腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)存在相同的優(yōu)勢(shì)配對(duì)TRBV10-3-TRBJ1-5,P2乳腺腫瘤組織和腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)存在相同的優(yōu)勢(shì)配對(duì)TRBV2
8、7-TRBJ1-5,與腋窩無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和外周血不同。
5每例患者乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、外周血樣本T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3受體庫(kù)各個(gè)樣本之間有著不同比例的CDR3重疊。其中,乳腺腫瘤組織與腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)重疊相對(duì)較高,在乳腺腫瘤組織、腋窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腋窩無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和外周血的重疊序列中,乳腺腫瘤組織高頻表達(dá)的序列在外周血表達(dá)較低。
結(jié)論:
乳腺癌患者乳腺腫瘤組織、腋
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