雌激素通過α-受體亞型途徑促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移.pdf

1、目的:觀察17β雌二醇(17β-estradiol,E2)及其受體激動(dòng)劑PPT(選擇性雌激素受體(ER)α激動(dòng)劑)、DPN(選擇性雌激素受體(ER)β激動(dòng)劑)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells EPCs)增殖和遷移的影響。探討E2可能通過何種ER亞型起作用。
　　 方法:(1)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞的分離:抽取健康足月孕產(chǎn)婦胎盤臍帶血60ml,按20U/ml加入普通肝素抗凝,采用明膠沉淀聯(lián)合密度梯度

2、離心法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞活力計(jì)算(死細(xì)胞著藍(lán)色、活細(xì)胞不著色),活細(xì)胞占98％以上可進(jìn)行接種,上述過程在四個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。(2)誘導(dǎo)分化:將細(xì)胞以4×106/cm2密度接種于纖維連接蛋白包被的25cm2培養(yǎng)瓶中(4μg/cm2),加入5ml M199培養(yǎng)基,添加10％胎牛血清、1％青鏈霉素(1萬單位/ml)、VEGF50ng/ml、b-FGF1ng/ml,置于5％CO2、飽和濕度、37℃孵育箱中,成纖維細(xì)胞多于24小時(shí)以內(nèi)貼壁

3、,24小時(shí)后取未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至第四天,用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細(xì)胞,加培養(yǎng)液培養(yǎng)至第七天,進(jìn)一步用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞供試驗(yàn)用。(3)EPCs鑒定:取細(xì)胞爬片先后加入硫氰酸熒光素標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)、DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-ac-LDL)孵育,熒光顯微鏡觀察；7d的EPCs進(jìn)行CD133免疫熒光鑒定。(4)研究E2、PPT和DPN對(duì)EPCs增殖及遷移的影響。培養(yǎng)的EPCs分別加入不

4、同濃度的E2、PPT和DPN進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析(WST)、顯微鏡下EPCs計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測EPCs細(xì)胞周期。另外將EPCs細(xì)胞懸液接種于Coster Transwell(膜直徑6.5mm,孔徑8um)的上層,下層加入600ul的培養(yǎng)液,并分別在培養(yǎng)液中加入不同濃度的E2、PPT和DPN孵育24h(實(shí)驗(yàn)均設(shè)雙復(fù)孔)。于高倍鏡下計(jì)數(shù)定向遷移至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)目,研究E2、PPT和DPN對(duì)細(xì)胞遷移的影響。
　　 結(jié)果:(1)

5、培養(yǎng)3-4天的單核細(xì)胞開始貼壁；7天后呈簇狀生長,并有一定方向性；9天可見多個(gè)血島樣細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)。免疫熒光鑒定顯示>90％的貼壁細(xì)胞呈雙熒光染色陽性,CD133免疫熒光檢測顯示綠色陽性率>90％。(2)WST實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)E2及PPT能促進(jìn)EPCs的增殖,呈濃度依賴性,而DPN對(duì)EPCs的增殖無明顯影響。E2在1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7 mol/L濃度下,450nm吸光光度值分別為

6、0.3466±0.0132、0.5083±0.016、0.5397±0.020、0.4785±0.0189；PPT在同等濃度下其吸光光度值為0.3265±0.1290、0.4503±0.0210、O.5040±0.0161、0.4272±0.0220,各濃度的E2組和PPT組與空白對(duì)照組0.2961±0.0106相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DPN在同等濃度下其吸光光度值為0.2963±0.0141、0.3129±0.0483、

7、0.2951±0.013、0.3016±0.0241,與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同等濃度的E2及PPT與DPN組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同等濃度的E2與PPT相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)手工計(jì)數(shù)顯示E2及PPT作用后EPCs數(shù)增多,在1×10-8mol/l濃度下分別為(2.83±0.29)±105個(gè)、(2.56±0.11)×105個(gè),與對(duì)照組(2.21±0.09)×105個(gè)相比有明顯統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義(P<0.05),DPN(2.21±0.99)x105個(gè)與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； E2、PPT與DPN組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E2與PPT相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(4)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明E2及PPT作用后,S期的EPCs所占百分比為(17.26±3.89)％、(12.1±1.84)％,分別與空白對(duì)照組(2.93±0.15)％相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),DPN(3.37±0.64)

9、％與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；E2作用后G1期細(xì)胞所占比例為(72.5333±6.2645)％,分別與對(duì)照組(87.2667±7.9758)％、DPN(87.6±0.7104)％相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),E2與PPT(77.3±5.2602)％相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(5)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明E2及PPT能促進(jìn)EPCs的遷移,濃度在1×10-8mol/l時(shí)作用最強(qiáng),E2在1×10-10mol/L、1×1

10、0-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L濃度下遷移至下層細(xì)胞數(shù)分別為35.64±4.9、44.26±3.93、50.10±6.22、39.81±4.73個(gè),PPT在同等濃度下為29.00±3.61、40.06±4.68、43.47±4.78、35.18±2.71,與空白對(duì)照組相比18.78±1.35個(gè)相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DPN為18.97±2.01個(gè)、22.13±4.14個(gè)、24.72±3.43