NAG7基因通過雌激素受體促進鼻咽癌細胞運動侵襲的分子機制.pdf

1、【NAG7基因的克隆、生物信息學(xué)特征及前期研究結(jié)果】 NAG7基因是謝奕博士采用定位候選克隆策略結(jié)合生物信息學(xué)方法，從最小共同缺失區(qū)3p25.3-26.3中成功克隆的與鼻咽癌相關(guān)基因。 生物信息學(xué)顯示，NAG7基因cDNA全長1677bp，編碼94個氨基酸的堿性蛋白質(zhì)，分子量為11023.87道爾頓，預(yù)測為一跨膜蛋白質(zhì)，其N端位于膜內(nèi)，跨膜區(qū)為33-52位氨基酸，含有1個蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點和1個肉豆蔻基(My

2、ristyl)化位點。 NAG7基因前期功能研究結(jié)果表明，NAG7基因在鼻咽癌活檢組織和鼻咽癌上皮HNEl細胞系中表達下調(diào)甚至缺失，而在正常鼻咽組織中存在明確的表達；NAG7基因編碼產(chǎn)物為一胞漿蛋白，NAG7基因在鼻咽癌細胞中的過表達，可導(dǎo)致鼻咽癌細胞HNEl蛋白質(zhì)表達譜和基因表達譜改變，抑制HNEl細胞和裸鼠皮下移植瘤生長，細胞周期素表達下調(diào)，G0/G1期細胞增加，S期細胞減少，凋亡細胞增加。 【NAG7基因在惡性腫瘤

3、細胞系中的表達】 利用RT-PCR技術(shù)分析NAG7基因在七種惡性腫瘤細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)NAG7基因在HNEl、CNEl、6-10B、SW480、Bel-7402和U251等六種惡性腫瘤細胞系中表達減少，而在5-8F細胞系中呈現(xiàn)高表達。為了明確NAG7基因在惡性腫瘤細胞系中的表達減少是否與其編碼區(qū)序列的突變相關(guān)，進一步從這幾種細胞系的基因組DNA中擴增NAG7基因的編碼區(qū)序列并進行測序分析。結(jié)果顯示HNEl、CNEl、6-10B

4、、SW480、Bel-7402、U251和5-8F等七種細胞基因組DNA中均可擴增出NAG7基因的編碼區(qū)序列，測序分析表明HNEl、CNEl、6-10B、SW480、Bel-7402和U251細胞中擴增出來的NAG7基因均在第30位氨基酸的第二個密碼子發(fā)生了終止突變(NAG7基因編碼序列的第86位，T→G)，而5-8F細胞中擴增出來的NAG7基因為正確的編碼區(qū)序列。因此，NAG7基因在這六種惡性腫瘤細胞系中的表達下調(diào)可能為基因突變所致。

5、 NAG7基因能明顯抑制鼻咽癌HNEl細胞體內(nèi)、外生長，并且在不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞系中存在表達差異(HNEl、CNEl、6-10B、SW480、Bel-7402和U251等六種低/無侵襲轉(zhuǎn)移潛能惡性腫瘤細胞系表達減少，高侵襲轉(zhuǎn)移潛能的5-8F細胞系高表達)和序列突變(無/低侵襲轉(zhuǎn)移潛能細胞系中氨基酸第29位終止突變)。NAG7在不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的惡性腫瘤細胞系，特別是在5-8F和6-10B細胞系中存在差異表達，因此提出假設(shè)：NAG

6、7基因是否參與了鼻咽癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移? 【NAG7基因促進鼻咽癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的表型研究】 根據(jù) NAG7基因的表達水平和細胞系的侵襲轉(zhuǎn)移潛能，選擇3種細胞系作為研究對象：高侵襲轉(zhuǎn)移能力的5-8F、低侵襲轉(zhuǎn)移能力的HNEl和無侵襲轉(zhuǎn)移能力的6-10B。由于NAG7基因序列中未能預(yù)測到合適的RNAi序列，不能對5-8F細胞達到有效的干擾效果，因此構(gòu)建NAG7真核表達載體pEGFP-C2/NAG7，考察NAG7基因在6-10B

7、細胞和HNEl細胞中的過表達對鼻咽癌細胞運動侵襲表型的影響。研究發(fā)現(xiàn)，NAG7基因能夠增加鼻咽癌細胞HNEl和6-10B與細胞外基質(zhì)的粘附，增加HNEl和6.10B細胞與內(nèi)皮細胞粘附，及增強HNEl細胞的侵襲能力和運動遷移能力，但對6-10B細胞作用甚微。NAG7基因不能恢復(fù)HNEl和6-10B細胞的細胞間隙連接通訊能力。此外，NAG7基因還可以提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管生成能力。小鼠腎包膜下移植瘤實驗顯示，雖未發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)出現(xiàn)明顯腫瘤轉(zhuǎn)

8、移灶，但NAG7基因轉(zhuǎn)染的HNEl細胞明顯向腎內(nèi)侵襲，范圍和深度均顯著大于HNEl細胞，NAG7基因能明顯促進HNEl細胞向腎內(nèi)的侵襲。NAG7基因能夠明顯促進鼻咽癌HNEl細胞的運動侵襲潛能，但是對6-10B細胞作用甚微，說明NAG7基因并不具備啟動腫瘤細胞運動侵襲的作用，而是能促進腫瘤細胞的運動侵襲潛能。 【NAG7基因通過雌激素受體促進鼻咽癌HNEl細胞運動侵襲的分子機制】 利用人腫瘤相關(guān)寡核苷酸芯片篩選NAG7基

9、因調(diào)控鼻咽癌HNEl細胞的基因差異表達譜，根據(jù)芯片位點雜交的信號強度和t檢驗結(jié)合兩倍差異的標(biāo)準(zhǔn)，從2747個基因中篩選出差異表達基因共101個，其中上調(diào)34個，下調(diào)67個基因。選擇CAVl和MMPl基因，qRT-PCR.驗證其在NAG7/HNEl和HNEl細胞中的表達，并與基因芯片結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)表達量的改變與芯片結(jié)果較一致，說明芯片結(jié)果較準(zhǔn)確地反映了基因表達的變化。結(jié)合基因功能分類體系Gene Ontology(GO)，對差異表達基