雞精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是指位于睪丸精曲小管基膜上既能自我更新維持自身群體數(shù)量恒定，又能定向分化產(chǎn)生精母細(xì)胞的一類(lèi)干細(xì)胞。由于SSCs在體外基因修飾、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)等方面比胚胎干細(xì)胞更具優(yōu)勢(shì)，SSCs逐漸成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究探索了三種不同的飼養(yǎng)層，即睪丸支持細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚肝細(xì)胞對(duì)SSCs體外培養(yǎng)的影響以及培養(yǎng)傳代后SSCs保持多能性的潛力；應(yīng)用特異性化學(xué)物質(zhì)定

2、向誘導(dǎo)雞胚SSCs向成骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，并對(duì)各誘導(dǎo)劑的組合效果及適合濃度進(jìn)行了比較。以期能為禽類(lèi)SSCs的研究和利用提供參考資料，為醫(yī)學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)素材。研究結(jié)果總結(jié)如下幾點(diǎn)： 1．分別以睪丸支持細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚肝細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，比較三種不同的飼養(yǎng)層對(duì)SSCs體外培養(yǎng)的影響。結(jié)果顯示：以雞胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)SSCs可傳至四代，每代的AKP陽(yáng)性克隆率分別為45％、40％、36％和21％。以睪丸支持細(xì)胞為飼養(yǎng)層

3、進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)傳至三代，每代的．AKP陽(yáng)性克隆率分別是40％、32％、和22％。而以雞肝細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，SSCs未見(jiàn)有克隆形成，不能進(jìn)行傳代培養(yǎng)，表明雞胚成纖維細(xì)胞適合作為SSCs的飼養(yǎng)層，而雞胚肝細(xì)胞不適合作為SSCs飼養(yǎng)層。 2．以地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)雞胚SSCs向成骨細(xì)胞分化，比較以上各種誘導(dǎo)劑不同濃度和不同組合形成的誘導(dǎo)液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，對(duì)傳代后SSCs的誘導(dǎo)分化效果，鈣結(jié)節(jié)Von Kossa’s

4、法、改良的鈣鈷法及免疫組化法對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：誘導(dǎo)分化液Ⅱ+Ⅲ的誘導(dǎo)分化效果最好，誘導(dǎo)分化率為85％，與單獨(dú)使用誘導(dǎo)分化液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的差異顯著(p<0.01)，但與單獨(dú)使用誘導(dǎo)液I的差異不顯著(P>0.05)，其誘導(dǎo)效果略好于單獨(dú)使用誘導(dǎo)液Ⅰ(誘導(dǎo)分化率為83％)。SSCs被誘導(dǎo)15-21天后分化為成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞Von Kossa’s染色可見(jiàn)細(xì)胞間布滿(mǎn)黑色顆粒，提示有礦化基質(zhì)沉積；改良鈣鈷法堿性磷酸酶染色胞漿呈深

5、棕色或深黑色，免疫組化法染色細(xì)胞呈陽(yáng)性。 3．以維甲酸(RA)、BHA、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)SSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，比較以上各種誘導(dǎo)劑不同濃度和不同組合形成的誘導(dǎo)液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，對(duì)傳代后SSCs的誘導(dǎo)分化效果，甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：誘導(dǎo)分化劑Ⅰ(RA)和誘導(dǎo)分化劑Ⅱ(IBMX)的誘導(dǎo)分化效果最好，誘導(dǎo)分化率分別為83％、81％，兩者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但與其他誘導(dǎo)分化