新型多聚體微泡攜帶藥物舒尼替尼靶向治療腎細(xì)胞癌的離體和在體實驗研究.pdf

1、目的：化療是腫瘤治療的一個重要手段。但目前絕大多數(shù)化療藥物在發(fā)揮抑瘤作用的同時會引起機(jī)體嚴(yán)重的副作用,因而影響其最終療效。如何選擇合適的化療藥物及給藥方式,使其在體內(nèi)最大程度的發(fā)揮藥理作用并盡量減少并發(fā)癥一直是醫(yī)學(xué)研究的重點。近些年發(fā)展起來的超聲介導(dǎo)的藥物靶向運輸治療腫瘤已成為研究的熱點問題。本實驗通過研制新型多聚體超聲微泡作為藥物載體,攜帶抗腎癌藥物舒尼替尼形成新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體,評估離體實驗中其在超聲輻照的作用下對人腎癌GR

2、C-1細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡效應(yīng),并初步探索將其應(yīng)用于在體腎癌靶向治療的可行性和有效性。
　　方法：制備攜帶有藥物舒尼替尼的新型多聚體微泡,將表面活性劑Span60、Tween80以及不同聚合度的PEG溶于PBS中,向溶液內(nèi)通入SF6氣體,應(yīng)用高強(qiáng)度超聲處理得到超聲微泡,同時利用跨膜銨梯度法制備得到包含有藥物舒尼替尼的脂質(zhì)體,將超聲微泡和載藥脂質(zhì)體直接混合得到新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體。采用庫爾特粒度儀檢測微泡及脂質(zhì)體的粒徑分布

3、,通過Photoshop軟件進(jìn)行圖像分析評估微泡濃度,通過吸光度檢測計算脂質(zhì)體對藥物舒尼替尼的包封率。應(yīng)用熒光膽固醇25-NBD-Cholesterol制備帶有熒光的脂質(zhì)體,與微泡連接后在熒光顯微下觀察,證實脂質(zhì)體在微泡表面的有效粘附。通過觀測流式細(xì)胞儀檢測中吸收曲線的變化,驗證新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體中藥物舒尼替尼的有效加載。離體實驗中,將體外培養(yǎng)的人腎癌GRC-1細(xì)胞隨機(jī)分為6組:空白對照組(Control)、單純微泡組(MB)、

4、單純脂質(zhì)體組(Lipsome)、舒尼替尼組(Sunitinib)、加載有舒尼替尼的新型多聚體微泡不聯(lián)合超聲組(pMBS-US)和加載有舒尼替尼的新型多聚體微泡聯(lián)合超聲組(pMBS+US)。通過改變各實驗組不同的藥物濃度和作用時間,應(yīng)用MTT法觀察不同處理組的細(xì)胞生存率,應(yīng)用Caspase-3抗體與FITC熒光共同染色法檢測細(xì)胞凋亡,應(yīng)用DAPI熒光染色法觀察凋亡細(xì)胞的核變化,同時應(yīng)用透射電子顯微鏡觀測凋亡細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的變化。在體實驗中,采

5、用引瘤后原代細(xì)胞培養(yǎng)注射細(xì)胞懸液法建立裸鼠RCC皮下移植瘤模型,并隨機(jī)分為空白對照組(Control)、多聚體微泡組(pMB)、單純舒尼替尼治療組(Sunitinib)和加載有舒尼替尼的新型多聚體微泡聯(lián)合超聲治療組(pMBS+US)共4組。采用體內(nèi)循環(huán)體外抽檢的方法進(jìn)行新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體在體循環(huán)穩(wěn)定性的檢測,應(yīng)用超聲儀實時監(jiān)測不同實驗組裸鼠腫瘤生長變化并描繪腫瘤生長曲線,同時應(yīng)用Micro-CT檢測評估腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移情況,隨時觀

6、察記錄藥物舒尼替尼相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生。
　　結(jié)果：新型多聚體超聲微泡的平均直徑為3.17μm,濃度為3×109/mL,含藥脂質(zhì)體的平均粒徑為165nm,其對舒尼替尼的包封率約為78％。熒光顯微鏡下脂質(zhì)體有效粘附在微泡表面。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,藥物舒尼替尼成功加載于新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體中。離體實驗中,結(jié)果顯示載藥新型微泡復(fù)合物對人腎癌GRC-1細(xì)胞有明顯的生長抑制及促進(jìn)凋亡作用,其中,pMBS+US組對該腫瘤細(xì)胞的增殖抑制及誘

7、導(dǎo)凋亡作用強(qiáng)于其他處理組及對照組,且抑制程度隨作用時間的增長和作用藥物濃度的增加而增加。在體實驗中,結(jié)果顯示載藥新型微泡復(fù)合物對裸鼠RCC有明顯的生長抑制作用,其中,pMBS+US組對該腫瘤生長的抑制作用與其余各組相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異,甚至優(yōu)于單純使用藥物治療。以上體內(nèi)實驗的結(jié)果與體外實驗結(jié)果相對應(yīng),具有前后一致性。
　　結(jié)論：無論是體內(nèi)還是體外實驗,最有效的RCC治療方案都需要新型多聚體載藥微泡、有效的藥物舒尼替尼及超聲的定點照