透明質(zhì)酸接枝姜黃素前體藥物的急性腎損傷靶向治療研究.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是指一種由多種侵襲因素（如缺血、藥物、毒素等）造成腎功能在短期內(nèi)急性減退的臨床綜合征，迄今仍無有效治療手段。腎小管上皮細胞是缺血、藥物、毒素等侵襲因素導(dǎo)致AKI的主要靶細胞，AKI可引起腎小管上皮細胞變性、凋亡、壞死以及脫落，造成腎小球濾過率下降。因此，從逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細胞的損傷過程入手，尋找一種有效的治療AKI的手段具有十分重要的研究價值與臨床意義。
　　近來研究發(fā)現(xiàn)，

2、黏附因子CD44在正常腎臟組織內(nèi)無表達或表達極少，但在部分增殖性腎臟疾病及炎癥性腎臟疾病中CD44蛋白表達可異常增高，而透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)正是黏附因子CD44的天然存在的特異性配體之一，且HA具有良好的水溶性、分子中眾多的羥基和羧基，這為腎小管上皮細胞靶向前體藥物的研發(fā)提供了可能。本課題以HA作為載體，具有抗氧化應(yīng)激作用的姜黃素(Curcumin，CUR)為模型藥物，來構(gòu)建透明質(zhì)酸接枝姜黃素前體藥物(HA-

3、CUR)用于急性腎損傷的靶向治療。通過促進藥物在病變腎臟部位的有效蓄積，在提高藥物療效的同時，降低藥物潛在的副作用。
　　在脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)和催化劑4-二甲氨基口比啶（4-Dimethylaminopyridine，DMAP）作用下，利用HA（分子量:4000）上羧基與CUR羥基之間的酯化反應(yīng)，合成HA-CUR前體藥物。采用核磁共振對所得的前體藥物進行結(jié)構(gòu)確證，結(jié)果

4、表明已經(jīng)成功合成了目標(biāo)結(jié)合物。合成的HA-CUR前體藥物為深黃色固體粉末，其中CUR含量為8.57±0.69％。HA-CUR的平衡溶解度實驗結(jié)果顯示，CUR的平衡溶解度為226.8±7.3μg/mL，相比于游離的CUR（8.4±1.3μg/mL）提高了27倍。采用透析袋法分別考察HA-CUR和游離CUR在PBS(pH7.4)和含10％胎牛血清的PBS(pH7.4)中的體外釋放行為，結(jié)果HA-CUR可顯著延緩CUR的釋放，12小時內(nèi)累積釋

5、放出約80％的藥物，且在PBS(pH7.4)和含10％胎牛血清的PBS(pH7.4)中的釋放行為無顯著差異。
　　利用熒光顯微鏡觀察HA-CUR的細胞攝取。結(jié)果表明，相比于正常的腎小管上皮（HK-2）細胞，HA-CUR更容易被氧化應(yīng)激(H2O2)損傷的HK-2細胞所攝取。另外，氧化應(yīng)激損傷的HK-2細胞對HA-CUR的攝取也要多于游離CUR。采用近紅外熒光探針吲哚菁綠(ICG)標(biāo)記HA-CUR，以AKI裸鼠為模型進行活體近紅外成像

6、實驗，結(jié)果顯示熒光信號在AKI裸鼠中的分布主要在腎臟組織，且維持時間超過24小時。相比之下，對照組裸鼠腎臟部位無明顯的熒光信號分布。以游離CUR組為對照組，采用超高效液相色譜法測定藥物濃度，考察HA-CUR的體內(nèi)分布情況，結(jié)果顯示游離CUR組藥物主要分布在肺部，且較快代謝消除;而HA-CUR組藥物在腎臟的分布顯著增加，且明顯高于其他非靶部位。
　　本課題采用腎缺血再灌注來構(gòu)建AKI小鼠模型，免疫組化法考察AKI小鼠腎臟中CD44的

7、表達情況，結(jié)果表明，相比于對照組，AKI小鼠腎小管CD44的表達明顯增加。此外，采用免疫印跡法對CD44的表達進行測定并得出一致的結(jié)論，即AKI發(fā)生時，腎臟CD44表達顯著升高，這為HA-CUR用于腎靶向治療提供足夠的依據(jù)。
　　最后對HA-CUR的體內(nèi)藥效學(xué)進行評價，以腎缺血再灌注（Ischemia-reperfusion injury,IRI）來構(gòu)建AKI小鼠模型，通過尾靜脈注射給藥，考察并評價游離CUR和HA-CUR對模型小

8、鼠的體內(nèi)藥效。結(jié)果顯示:給藥24h后，HA-CUR降低血清肌酸酐(serum creatinine，Scr)和血液尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平的作用要強于游離CUR;蘇木精-伊紅(HE)染色給藥24h后小鼠腎臟組織，觀察其病理形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HA-CUR治療后，AKI小鼠腎臟出現(xiàn)的小管壞死和堵塞的情況得到明顯的改善，且效果要優(yōu)于游離CUR;AKI小鼠腎臟內(nèi)致炎因子水平降低，氧化應(yīng)激水平被抑制，且HA-CU

9、R組強于游離CUR組;采用免疫印跡法對腎臟組織中凋亡相關(guān)蛋白進行測定，結(jié)果顯示，HA-CUR可顯著降低凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3的表達，升高Bcl-2的水平，且作用要優(yōu)于游離CUR。
　　研究結(jié)果表明，所構(gòu)建的HA-CUR前體藥物在AKI小鼠模型體內(nèi)，可通過與氧化應(yīng)激損傷的腎小管上皮細胞結(jié)合，改善其體內(nèi)分布，提高藥物在靶部位的治療效果。結(jié)果提示，將透明質(zhì)酸接枝姜黃素后，有望通過藥物的腎靶向蓄積，減少非靶位組織的分布，減