糖基化終末產(chǎn)物通過氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景：阿爾茨海默病（AD）是老年人常見的疾病之一，嚴(yán)重影響人類的身心健康，給患者家庭及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。近年來越來越多的研究顯示，2型糖尿病與AD的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，Luchsinger等對1262名老年人群調(diào)查顯示1/3的癡呆與糖尿病有關(guān)，相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DM患者發(fā)生AD的危險(xiǎn)性是非DM患者的2倍。糖尿病導(dǎo)致AD發(fā)生的機(jī)制與胰島素細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、高膽固醇血癥及高血糖狀態(tài)下非酶糖基化反應(yīng)生成的糖基化終末產(chǎn)物(advan

2、ced glycation end products，AGEs)有關(guān)。糖的醛基和蛋白質(zhì)的氨基經(jīng)過復(fù)雜的非酶糖基化反應(yīng)（Maillard反應(yīng)）生成一類不可逆聚合物，即糖基化終末產(chǎn)物，AGEs在糖尿病視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈硬化、糖尿病腎病等靶器官損害中發(fā)揮重要作用，而AD患者腦內(nèi)老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)中均發(fā)現(xiàn)有AGEs的聚積，Takeuchi和Maczurek等研究也指出，AGEs在糖尿病所致的認(rèn)知功能障礙和AD病理變化中起著非常重要的作用，是引

3、起老年人認(rèn)知功能下降的危險(xiǎn)因素之一。AGEs能夠促進(jìn)蛋白的聚積與交聯(lián)，直接抑制蛋白的正常功能，并能夠通過促進(jìn)活性氧(reative oxygen species，ROS)的產(chǎn)生對機(jī)體造成生物損傷，除此之外還能與其特異性受體(主要是RAGE)結(jié)合進(jìn)而通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其間接毒性作用。
　　 AD的典型病理改變是在特定腦區(qū)內(nèi)出現(xiàn)老年斑(senile plaques，SPs)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillaryta

4、ngles，NFFs)、神經(jīng)元及突觸丟失。神經(jīng)元進(jìn)行性減少是AD的重要病理特征，其中，細(xì)胞凋亡起了主導(dǎo)作用。凋亡是程序性的細(xì)胞死亡過程，外源性死亡受體途徑、內(nèi)源性線粒體凋亡通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程目前是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡的主要通路，近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡途徑在多種疾病如糖尿病、腦梗塞、阿爾茨海默病的發(fā)病中扮演了重要角色，我們以往研究提示AGEs參與APP異常代謝及AB的生成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是生成Aβ1-42的主要場所，在APP

5、的代謝中起著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊功能障礙、鈣平衡的破壞及氧化反應(yīng)的異常等都會(huì)觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。AGEs是否通過觸發(fā)氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡參與AD發(fā)生發(fā)展尚不清楚，為此，我們設(shè)計(jì)該課題，選擇非常接近正常神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及生理功能的入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y，以此為研究對象，以非酶糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin，AGE-BSA)處理細(xì)胞，并分別以抗RAGE中和抗體

6、(RAGE-antibody,RAGE-Ab)、抗氧化劑α-硫辛酸(alpha lipoic acid, ALA)及NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘(diphenyleneiodonium，DPI)預(yù)處理細(xì)胞探討AGEs是否通過氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡，揭示AGEs參與阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展的可能相關(guān)機(jī)制。
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過研究AGEs對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響及氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在該過程中的作用，探

7、討AGEs參與AD發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　 方法：選擇體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞為模型，分別以不同濃度(0、50、100、200、300μg/mL)的糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-BSA)處理SH-SY5Y細(xì)胞48h，選取AGE-BSA敏感濃度200μg/mL處理細(xì)胞不同時(shí)間(24、36、48h)，流式細(xì)胞儀(FCM)分別檢測各組細(xì)胞凋亡率，確定AGE-BSA誘導(dǎo)SH-SY5Y凋亡最佳濃度及時(shí)間:將細(xì)胞隨機(jī)分為6組:正常

8、對照組、BSA對照組(200μg/mL BSA)、AGE-BSA組(200μg/mLAGE-BSA)、AGE-BSA+RAGE-Ab組:預(yù)先用抗RAGE-Ab(10μg/mL)干預(yù)細(xì)胞1h，再加入AGE-BSA(200μg/mL);AGE-BSA+ALA組:預(yù)先用ALA（終濃度200μmol/L）干預(yù)細(xì)胞1h，再加入AGE-BSA(200μg/mL);AGE-BSA+DPI組:先加DPI（30nmol/L）干預(yù)1h，加入AGE-BSA(

9、200μg/mL)。處理48h后FCM檢測各組細(xì)胞凋亡率，Hoechst33258熒光染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)變化;應(yīng)用活性氧熒光探針DCFH-DA檢測AGE-BSA干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞不同時(shí)間(0、12、24、48h)后活性氧(ROS)水平，及不同藥物處理48h后細(xì)胞ROS水平;通過免疫細(xì)胞熒光化學(xué)及免疫蛋白印跡方法觀察AGEs處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、12、24、48h)后GRP78、p-eIF2α、Caspase-12的蛋白表達(dá)情況;

10、選取各蛋白表達(dá)高峰時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫蛋白印跡方法檢測各不同處理組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)GRP78、p-eIF2α、 Caspase-12蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果
　　 1.FCM測細(xì)胞凋亡率
　　 1.1正常細(xì)胞凋亡率為（2.23±0.08）％，50、100、200、300μg/mLAGE-BSA作用48 h后凋亡率分別為（2.98±0.67）％、（8.23±0.42）％、(16.8±1.27)％、(19.6±2.

11、89)％;200μg/mL AGE-BSA作用24、36、48 h后凋亡率分別為(7.54±1.08)％、(10.75±1.19)％、(16.8±1.27)％，提示AGE-BSA能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨AGE-BSA濃度增加及時(shí)間延長而增高。
　　 1.2分別用RAGE中和抗體、ALA、DPI預(yù)處理細(xì)胞后再加入AGE-BSA200μg/mL作用48 h，細(xì)胞凋亡率分別為（5.18±0.16）％、(5.94±0.10)％、（7.

12、26±1.22）％，與AGE-BSA組相比凋亡率分別下降69.1％、64.6％、56.8％，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)，BSA對照組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.Hoechst33258熒光染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài):不同處理組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258染色在熒光顯微鏡下觀察形態(tài)，正常對照組和BSA對照組細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光，無核濃聚，AGE-BSA組可見大量散在凋亡樣改變的細(xì)胞核，表現(xiàn)為亮藍(lán)色

13、，出現(xiàn)核碎裂，熒光強(qiáng)度比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)，抗RAGE-Ab、ALA、DPI預(yù)處理組均可見細(xì)胞熒光強(qiáng)度比AGE-BSA組降低，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少。
　　 3.DCFH-DA檢測SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平
　　 3.1 AGE-BSA干預(yù)0h的細(xì)胞內(nèi)僅有少量ROS，AGE-BSA干預(yù)細(xì)胞12h可見細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，接近0h組細(xì)胞的4倍，并且隨AGE-BSA作用時(shí)間的延長，ROS水平不斷增高，與0h組細(xì)胞比較差異具有

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.2 AGE-BSA及不同預(yù)處理48h檢測ROS水平:與正常組比較，AGE-BSA組細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增多（尸＜0.01），是正常組的6.95倍，而NC組與BSA對照組比較無顯著差異，RAGE-Ab組、ALA組、DPI組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較AGE-BSA組分別下降56.2％、46.5％、54.3％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示AGEs可能通過與其受體RAGE結(jié)合進(jìn)而激活NADPH氧化

15、酶促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。
　　 4.免疫細(xì)胞熒光化學(xué)及免疫蛋白印跡方法觀察SH-SY5Y細(xì)胞中的GRP78、p-eIF2α、Caspase-12蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析
　　 4.1免疫細(xì)胞熒光化學(xué)方法觀察GRP78、p-eIF2α、Caspase-12在SH-SY5Y細(xì)胞的表達(dá)，AGE-BSA處理后熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，GRP78主要在胞漿表達(dá)，而p-eIF2α全細(xì)胞都有表達(dá)，但胞核熒光強(qiáng)度更高，免疫蛋白印跡方法結(jié)果

16、顯示AGE-BSA分別處理細(xì)胞0、12、24、48h，GRP78、p-eIF2α、Caspase-12蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增高，GRP78、p-eIF2α在AGEs處理24h后出現(xiàn)表達(dá)峰值，Caspase-12在48h出現(xiàn)表達(dá)高峰。
　　 4.2按分組要求給予細(xì)胞不同處理24h，免疫蛋白印跡結(jié)果提示AGEs組GRP78、p-eIF2α蛋白表達(dá)水平分別為正常對照組的3.56倍、6.39倍，而預(yù)先用抗RAGE-Ab、DPI、AL

17、A分別處理細(xì)胞可以顯著降低GRP78、p-eIF2α的表達(dá)，GRP78下降率分別為39.5％、14.1％、19.3％，p-eIF2α下降率分別為28％、41％、33％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。處理48h后檢測Caspase-12蛋白表達(dá)水平，Caspase-12在正常細(xì)胞和BSA組弱表達(dá)，AGE-BSA作用于細(xì)胞可上調(diào)Caspase-12蛋白表達(dá)，與正常組和BSA組比較差異均有顯著性(P＜0.01)，麗應(yīng)用抗RA

18、GE-Ab、ALA和DPI分別預(yù)處理細(xì)胞均可部分阻斷AGE-BSA導(dǎo)致的Caspase-12上調(diào)，下降率分別為35.9％、43.7％、50.5％，差異顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.AGEs通過與其受體RAGE結(jié)合，進(jìn)而激活SH-SY5Y的NADPH氧化酶促進(jìn)促進(jìn)ROS產(chǎn)生。
　　 2.AGEs可能通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生引發(fā)GRP78表達(dá)增加及PERK-eIF2α途徑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡