p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體作為舌鱗癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部惡性腫瘤中一種常見的病理類型，約占90％，而在口腔鱗癌中，最常見類型的其中之一就是舌鱗狀細(xì)胞癌。治療舌鱗狀細(xì)胞癌，目前主要采取綜合手術(shù)療法、放射療法、化學(xué)療法及生物療法等各種治療方法的序列治療方案，盡管取得一定的近期效果，但是遠(yuǎn)期治療效果仍不是十分理想，因該方案并沒有從根本上解決術(shù)后復(fù)發(fā)及癌瘤轉(zhuǎn)移等臨床腫瘤治療中的主要難題。
　　 近年來，隨著對腫瘤研究的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)某些腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞具有相似的生長

2、調(diào)控機(jī)制，腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells，CSC)的理論隨之誕生。該理論認(rèn)為:腫瘤組織中存在少量干細(xì)胞樣的癌細(xì)胞亞群，具有自我更新、多向分化及強(qiáng)增殖能力，能夠分化為構(gòu)成腫瘤的大部分細(xì)胞，并使腫瘤具有異質(zhì)、增殖、浸潤等特性，這一細(xì)胞亞群被稱為:腫瘤干細(xì)胞。雖然它們只占腫瘤的一小部分，卻是腫瘤起源、生長、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的根源所在。腫瘤干細(xì)胞理論的提出開啟了腫瘤治療領(lǐng)域的新紀(jì)元，突破了傳統(tǒng)癌癥治療的本質(zhì)觀念。通過對其生物學(xué)特性的研究并

3、建立相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，尋找靶向腫瘤干細(xì)胞的抗癌策略，以根治腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，成為研究的熱點(diǎn)。其中，選擇何種細(xì)胞表面標(biāo)志物來證實(shí)腫瘤干細(xì)胞的存在并完成對腫瘤干細(xì)胞的提取和鑒別是首要亟待解決的問題。
　　 p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體(p75neurotrophinreceptor，p75NTR)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，分子量為75kDa。是腫瘤壞死因子受體超家族的成員。在體內(nèi)，p75NTR可通過不同的信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖

4、、分化、遷移、凋亡等生物學(xué)行為。研究表明，其實(shí)現(xiàn)這一復(fù)雜生物學(xué)活性主要通過兩種途徑:①與Trks受體的相互調(diào)節(jié)作用;②參與促進(jìn)細(xì)胞存活或凋亡的自主信號的啟動(dòng)及調(diào)控作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)p75NTR的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，并已證實(shí)其在全身多種腫瘤中是可以作為一種腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物[2]。
　　 鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過研究p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca-8113及Cal-27中的表達(dá)，并采

5、用流式細(xì)胞分選技術(shù)對舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca-8113及Cal-27以p75NTR為標(biāo)志進(jìn)行分選，進(jìn)一步對其分選得到的p75NTR陽性癌細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究等，探討p75NTR作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物和預(yù)測口腔鱗狀細(xì)胞癌愈后指標(biāo)的可能性，為深入研究舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理和尋找新的治療靶點(diǎn)提供線索。
　　 第一部分舌鱗癌細(xì)胞系單細(xì)胞體外增殖及p75NTR的表達(dá)
　　 目的:研究p75NTR在舌鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)，并觀察舌鱗癌

6、Cal-27細(xì)胞系的單細(xì)胞體外增殖能力，尋找腫瘤干細(xì)胞存在的依據(jù)，探尋以p75NTR作為舌鱗癌干細(xì)胞膜蛋白標(biāo)志進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的可行性。
　　 方法:對舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca-8113和Cal-27進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，檢測癌細(xì)胞中p75NTR的表達(dá)。并對Cal-27細(xì)胞進(jìn)行體外單克隆培養(yǎng)，觀察Cal-27的增殖、分裂特性。并應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用x2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:p75NTR在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中有陽性

7、表達(dá)，百分比大約為3.1％(Tca-8113)和1.9％(Cal-27)。體外單克隆八天后，Cal-27細(xì)胞中仍有繼續(xù)增殖能力的細(xì)胞孔數(shù)占開始時(shí)細(xì)胞總量的13.8％;十二天后，這一比例降至4.4％;十六天后，僅有3.7％的細(xì)胞孔數(shù)繼續(xù)分裂增殖。
　　 結(jié)論:舌鱗癌細(xì)胞系Cal-27具有異質(zhì)性，只有微量細(xì)胞具有持續(xù)的分裂增殖能力，同時(shí)僅有極少量細(xì)胞呈p75NTR陽性表達(dá)，該結(jié)果提示p75NTR具有被作為腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的

8、可能性。但其在舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病過程中所起的作用及機(jī)制，及其與舌鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤干細(xì)胞的確切關(guān)系仍有待于我們進(jìn)一步的研究。
　　 第二部分p75NTR陽性舌鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)特征性相關(guān)研究
　　 目的:通過對舌鱗癌細(xì)胞系流式細(xì)胞儀分選獲得的p75NTR陽性細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究，探尋p75NTR陽性細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞的特性。
　　 方法:通過流式細(xì)胞儀分選獲取p75NTR陽性舌鱗癌細(xì)胞，進(jìn)行增殖能力、自我更新、

9、多項(xiàng)分化能力和成瘤能力的檢測:1.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測p75NTR陽性舌鱗癌細(xì)胞中CD44的表達(dá);2.對p75NTR陽性和未分選舌鱗癌細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)14天后比較其單克隆能力，收集p75NTR陽性舌鱗癌細(xì)胞形成單克隆的細(xì)胞正常培養(yǎng)兩周，檢測其p75NTR陽性比例;3.MTT實(shí)驗(yàn)比較p75NTR陽性和未分選的舌鱗癌細(xì)胞生長情況，并繪制細(xì)胞生長曲線;4.劃痕實(shí)驗(yàn)比較p75NTR陽性和未分選的舌鱗癌細(xì)胞遷移能力;5，體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)對比p75

10、NTR陽性和未分選的舌鱗癌細(xì)胞成瘤能力。
　　 結(jié)果:CD44在舌鱗癌細(xì)胞系Tca-8113和Cal-27的p75NTR陽性細(xì)胞中高表達(dá)，所占比例大約為50％。在舌鱗癌細(xì)胞系Tca-8113和Cal-27中p75NTR陽性細(xì)胞與未分選的對照組細(xì)胞相比，p75NTR陽性細(xì)胞的單克隆形成能力較同源的未分選的對照組細(xì)胞的單克隆形成能力相比均顯著增高(P＜0.01);單克隆化后的p75NTR陽性細(xì)胞再培養(yǎng)兩周后，檢測到大量p75NTR陰

11、性細(xì)胞，p75NTR+細(xì)胞的比例下降到14.5％和5.8％;MTT實(shí)驗(yàn)證明p75NTR陽性細(xì)胞生長均較迅速(P＜0.01);同時(shí)相對于未分選的細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力;p75NTR陽性細(xì)胞與未分選的對照組細(xì)胞相比，裸鼠體內(nèi)致瘤能力無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但p75NTR陽性細(xì)胞組成瘤速度快。
　　 結(jié)論:p75NTR陽性細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力、遷移能力、自我更新和分化能力以及較快的成瘤能力，且能夠在產(chǎn)生的子代細(xì)胞中保持其細(xì)胞特性，并能分化