組蛋白乙?；瘜撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境適應(yīng)性的調(diào)控作用及機(jī)制.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是治療括約肌功能障礙型(ISD)壓力性尿失禁的理想細(xì)胞,臨床上把BMSCs移植到尿失禁患者的尿道周圍,希望通過成體組織細(xì)胞對BMSCs的誘導(dǎo),使干細(xì)胞發(fā)生向相應(yīng)成體細(xì)胞的分化,以治療受損肌肉的排尿功能障礙。然而,至今為止該療法并沒有獲得預(yù)期的療效,究其原因是BMSCs誘導(dǎo)分化的機(jī)制研究較少,很多關(guān)鍵性的問題沒有解決直接影響著干細(xì)胞在臨床上的治療效果。
　　前期的一些實(shí)驗(yàn)中可以觀察到在體外膀胱平滑肌細(xì)胞

2、的微環(huán)境中BMSCs可向平滑肌細(xì)胞的表型分化,提示參與干細(xì)胞定向分化的信號(hào)可能存在于干細(xì)胞生存的微環(huán)境中,通過相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,啟動(dòng)干細(xì)胞的基因在時(shí)空上特異性表達(dá),合成特異性蛋白質(zhì),從而使細(xì)胞在功能、結(jié)構(gòu)等方面發(fā)生不同改變。微環(huán)境之所以能夠精密的調(diào)控干細(xì)胞向特定細(xì)胞分化,關(guān)鍵因素就是干細(xì)胞對其微環(huán)境的適應(yīng)性以及微環(huán)境對干細(xì)胞的潛在影響。因此,針對干細(xì)胞在微環(huán)境中的適應(yīng)性對于全面及清楚的認(rèn)識(shí)干細(xì)胞分化情況具有非常重要的理論意義,但是到目

3、前為止,與干細(xì)胞微環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)的具體機(jī)制仍不清楚。
　　因此研究干細(xì)胞在體內(nèi)外微環(huán)境誘導(dǎo)下的適應(yīng)性的調(diào)控變化及機(jī)制顯得十分重要。近幾年來組蛋白乙?；揎棇Ω杉?xì)胞分化的影響引起了人們廣泛關(guān)注,組蛋白乙酰化可能是干細(xì)胞微環(huán)境適應(yīng)性中重要的胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控事件,染色質(zhì)核小體組蛋白可以通過共價(jià)修飾而發(fā)生乙?；?、甲基化和磷酸化,其中與特異性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系最為密切的是組蛋白的乙酰化修飾,通過染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)DNA構(gòu)型疏密,并由染色質(zhì)不同位點(diǎn)組蛋

4、白的乙酰化修飾構(gòu)成了多種多樣的“組蛋白密碼”。一般而言,乙?；娜旧|(zhì)與基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān),相反的,去乙?；娜旧|(zhì)與基因轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān),啟動(dòng)子附近的組蛋白乙?；缴呖捎绊懚喾N生物的可誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄起始。因而在真核細(xì)胞中,組蛋白乙?；?去乙酰化對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是一個(gè)多層次、多步驟的復(fù)雜過程。
　　本實(shí)驗(yàn)取材于3周齡雌性SD大鼠,分別采用密度梯度離心法和膠原酶消化法,分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs;并模擬體內(nèi)盆底環(huán)境,

5、體外構(gòu)建膀胱平滑肌與BMSCs接觸培養(yǎng)體系,建立間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化模型,旨在研究組蛋白乙?；揎椩贐MSCs向平滑肌分化的意義以及膀胱平滑肌微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs適應(yīng)性的調(diào)控機(jī)制,主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)鑒定與共培養(yǎng)模型的建立
　　1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離與培養(yǎng)無菌操作下取3周齡雌性SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨,DMEM-F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔,沖洗液混勻,梯度密度離心棄上清后提取

6、沉淀,加入含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液中,置37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所得第三代貼壁細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其分子表型。結(jié)果:成功的分離出形態(tài)為梭形的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,其分子表型為:CD31、CD45陰性、CD29、CD44、陽性。
　　2.大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞(BSMCs)的分離與培養(yǎng)無菌操作條件下取3周齡雌性SD大鼠膀胱,采用膠原酶消化法分離膀胱平滑肌細(xì)胞,用含10%FBS的HG-DMEM培養(yǎng),所得貼壁細(xì)胞,免疫熒光

7、法鑒定其標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果:平滑肌標(biāo)志基因a-SMA,Calponin和SM-MHC均表達(dá)陽性。
　　3.建立大鼠膀胱平滑肌微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs體外分化模型BMSCs和膀胱平滑肌細(xì)胞分別種在懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室transwell多孔膜(1um)兩側(cè),cellcultureinserts放入六孔板中作為實(shí)驗(yàn)組,以未經(jīng)過共培養(yǎng)的同代同批次BMSCs作為對照組。收集接觸共培養(yǎng)4日后的BMSCs,RT-PCR、WesternBlot、及免

8、疫熒光檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組成肌分化后平滑肌標(biāo)志性蛋白。結(jié)果:RT-PCR、WesternBlot、及免疫熒光結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較對照組的BMSCs中平滑肌標(biāo)志性蛋白的表達(dá)量顯著增加,說明BMSCs在平滑肌微環(huán)境中成肌分化,建模成功。
　　二、組蛋白乙?；瘜MSCs向BSMCs分化的影響
　　1.微球菌核酸酶實(shí)驗(yàn)檢測BMSCs分化前后平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)開放性,將第三代BSMCs接種于培養(yǎng)小室transwell下室面,放

9、入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后將翻轉(zhuǎn)過的transwell放入含平滑肌培養(yǎng)液的六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。次日將BMSCs接種于膜內(nèi)面。分別收集共培養(yǎng)3天的實(shí)驗(yàn)組與對照組BMSCs,PCR檢測進(jìn)行不同時(shí)間微球菌核酸酶處理的實(shí)驗(yàn)組與對照組中三個(gè)標(biāo)志性基因α-SMA、calponin、SM-MHC啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)開放性。對PCR產(chǎn)物運(yùn)用凝膠分析軟件對DNA的量進(jìn)行定量分析。結(jié)果:隨著時(shí)間的遞增,分化后的BMSCs啟動(dòng)子區(qū)的PCR擴(kuò)增效率明顯低于未分化的BMSCs

10、,說明與BMSCs接觸共培養(yǎng)能顯著的增強(qiáng)BMSCs平滑肌相關(guān)蛋白啟動(dòng)子區(qū)域?qū)怂崦傅拿舾行?使啟動(dòng)子開放性增強(qiáng),開啟上游抗性基因和下游報(bào)告基因的表達(dá),增加外源基因的轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化頻率。
　　2.ChIP檢測α-SMA、SM-MHC以及Calponin啟動(dòng)子區(qū)H4表觀遺傳修飾狀態(tài),Transwell上室面取培養(yǎng)組和對照組中BMSCs,用甲醛固定活細(xì)胞,超聲將DNA打斷成不同大小的片段,用目的蛋白質(zhì)H4特異性抗體免疫沉淀該蛋白質(zhì)-DN

11、A復(fù)合物,復(fù)合物65℃解交聯(lián),分離純化DNA,后進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為98℃30s,變性94℃20s,退火60℃1min,延伸60℃1min,共40個(gè)循環(huán);Q-PCR檢測BMSCs分化前后平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)乙酰化差異。結(jié)果:經(jīng)共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后,α-SMA、SM-MHC和Calponin啟動(dòng)子區(qū)乙?；潭容^未分化前顯著增加,平滑肌標(biāo)志基因啟動(dòng)子區(qū)DNA的乙?；赡軈⑴c了BMSCs向SMCs分化過程。
　　結(jié)論:本研究成