兩種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的不同作用及機(jī)制.pdf

1、目的:與實(shí)體腫瘤相同，血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素同樣是原癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活。但與實(shí)體腫瘤不同的是，血液腫瘤的生長(zhǎng)增殖發(fā)生在一個(gè)精密而復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)——造血微環(huán)境中。正常情況下，造血微環(huán)境中具有調(diào)控活性的基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)合成和釋放造血因子和造血抑制因子來(lái)調(diào)控血細(xì)胞的生長(zhǎng)，并維持血細(xì)胞在不同階段的正常形態(tài)。
　　作為一種起源于多功能造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leu

2、kemia CML)通常以外周血白細(xì)胞的異常增高，CML白血病細(xì)胞以中性中、晚幼粒及成熟粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞增多等為特征。相較于正常骨髓象和血象，CML的這一系列變化恰恰說(shuō)明CML腫瘤細(xì)胞的生殖和分化打破了正常的造血調(diào)控的平衡，提示我們CML患者的骨髓造血微環(huán)境發(fā)生了異常變化。
　　為了研究骨髓造血微環(huán)境對(duì)CML腫瘤細(xì)胞的增殖是促進(jìn)還是抑制，我們選取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesench

3、ymal stem cell，BMMSCs)在體外模擬造血微環(huán)境中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，因?yàn)锽MMSCs是造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞，可以分化成各類(lèi)基質(zhì)細(xì)胞，并能分泌多種細(xì)胞因子參與骨髓造血的調(diào)控。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體通路中的TAB1、TBK1、MAPK11、CXCL10等基因在CML慢性期和急變期白血病細(xì)胞中的表達(dá)量存在著顯著差異，而這種差異是否在CML白血病細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用尚不清楚。
　　

4、為了很好的探索這一問(wèn)題，我們選用健康人來(lái)源的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株(Human Mesenchymal Stem Cell-bone marrow,HMSC-hm)和CML慢性期初治患者來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分別模擬健康人的骨髓微環(huán)境和CML患者的骨髓微環(huán)境，以K562細(xì)胞株模擬CML白血病細(xì)胞，采用K562細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的方式，構(gòu)建出一個(gè)類(lèi)似人體骨髓造血微環(huán)境對(duì)CML白血病細(xì)胞調(diào)控的模型，通過(guò)繪制K562細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

5、，檢測(cè)共培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α等細(xì)胞因子，比較不同方法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞TAB1、TBK1和NF-κB基因及蛋白產(chǎn)物表達(dá)情況的不同，比較不同方法培養(yǎng)的K562細(xì)胞中β-catenin基因及蛋白產(chǎn)物表達(dá)情況的不同，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的不同影響以及Toll樣受體通路在該調(diào)控過(guò)程中可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　方法:
　　1.第一部分、比較慢性髓細(xì)胞白血病患者的

6、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株對(duì)K562細(xì)胞增殖的不同作用
　　(1)分組，以K562細(xì)胞與慢性髓細(xì)胞白血病患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(CML-BMMSCs)共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組一，K562細(xì)胞與健康人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)組(HMSC-hm)為實(shí)驗(yàn)組二，以K562單獨(dú)培養(yǎng)組為對(duì)照組。
　　(2)CCK8法繪制K562細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡。
　　2.第二部分、兩種BMMSCs的

7、NF-κB、TAB1和TBK1基因和蛋白產(chǎn)物以及受其調(diào)控的細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α表達(dá)水平的比較
　　(1)分組，以CML-BMMSCs細(xì)胞和K562細(xì)胞共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組一，以HMSC-hm細(xì)胞和K562細(xì)胞共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組二，以CML-BMMSCs細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組為對(duì)照組一，以HMSC-hm細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組為對(duì)照組二。
　　(2)RT-PCR檢測(cè)TAB1基因、NF-κB基因和TBK1基因在四組骨髓間充

8、質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)中的表達(dá)情況。
　　(3)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)TAB1、NF-κB和TBK1蛋白產(chǎn)物在四組BMMSCs中的表達(dá)情況。
　　(4)以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)和比較各組IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α細(xì)胞因子分泌水平。
　　3.第三部分、兩種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響K562細(xì)胞株經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)途徑活性的初步研究
　　(1)分組，以K562細(xì)胞與CM

9、L-BMMSCs細(xì)胞共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組一，以K562細(xì)胞與HMSC-hm細(xì)胞共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組二，以K562單獨(dú)培養(yǎng)組為對(duì)照組一，以重組人干擾素α2b處理72小時(shí)的K562細(xì)胞為對(duì)照組。
　　(2)RT-PCR檢測(cè)β-catenin基因在四組K562細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　(3)Western blot檢測(cè)β-catenin蛋白在四組K562細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.三組K562細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明，0h到

10、48h之間三組K562細(xì)胞生長(zhǎng)均較為緩慢，48h至72h，三組K562細(xì)胞增殖開(kāi)始加速，但實(shí)驗(yàn)組二K562細(xì)胞生長(zhǎng)較其它兩組相對(duì)緩慢，差異存在顯著性(P＜0.05)，表明其增殖受到一定程度的抑制，而實(shí)驗(yàn)組一與對(duì)照組的K562增殖速度不存在顯著差異(P＞0.05)。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)72h后的三組K562細(xì)胞，其早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞的結(jié)果如下:實(shí)驗(yàn)組一1.52±0.10，實(shí)驗(yàn)組二13.33±7.68，對(duì)照組2.46±

11、0.88。實(shí)驗(yàn)組二最高，與實(shí)驗(yàn)組一及對(duì)照組存在十分顯著的差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組一和對(duì)照組不存在顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.四組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NF-κB、TAB1和TBK1的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　(1) NF-κB/β-actin mRNA表達(dá)值為:實(shí)驗(yàn)組一0.0402±0.0024，實(shí)驗(yàn)組二0.0196±0.0025，對(duì)照組一0.0214±0.0028，對(duì)照組二0.0188±0.0036。實(shí)驗(yàn)組一最高，

12、與實(shí)驗(yàn)組二、對(duì)照組一及對(duì)照組二相比均存在顯著的差異(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組二與對(duì)照組一及對(duì)照組二相比均不存在顯著的差異(P＞0.05);對(duì)照組一與對(duì)照組二相比差異性不顯著(P＞0.05)。
　　(2) TAB1/β-actin mRNA表達(dá)值為:實(shí)驗(yàn)組一0.0319±0.0086，實(shí)驗(yàn)組二0.0224±0.0051，對(duì)照組一0.0252±0.0030，對(duì)照組二0.0134±0.0046。其中，其中，實(shí)驗(yàn)組一、實(shí)驗(yàn)組二及對(duì)照組一兩兩

13、比較差異均不顯著(P＞0.05)，但三組與對(duì)照組二兩兩比較均存在顯著的差異(P＜0.05)。
　　(3) TBK1/β-actin mRNA表達(dá)值為:實(shí)驗(yàn)組一0.0406±0.0080，實(shí)驗(yàn)組二0.0584±0.0094，對(duì)照組一0.0504±0.0091，對(duì)照組二0.0614±0.0130。其中，對(duì)照組二最高，與實(shí)驗(yàn)組一相比較差異性顯著(P＜0.05)，但與實(shí)驗(yàn)組二及對(duì)照組一相比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組一、實(shí)驗(yàn)組二

14、和對(duì)照組二兩兩比較均不存在顯著差異(P＞0.05)。
　　4.四組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NF-κB、TAB1和TBK1蛋白產(chǎn)物Western blot檢測(cè)結(jié)果
　　(1)四組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能表達(dá)NF-κB蛋白，但對(duì)照組二與其它三組相比較已經(jīng)明顯收窄。Quantity One圖像分析軟件分析NF-κB蛋白條帶的光密度值結(jié)果及其柱狀圖表明，NF-κB蛋白濃度由高到低依次為實(shí)驗(yàn)組一、對(duì)照組一、實(shí)驗(yàn)組二和對(duì)照組二。
　　(2)四

15、組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能表達(dá)TAB1蛋白，但對(duì)照組二的蛋白條帶較其它三組條帶明顯收窄。使用Quantity One圖像分析軟件分析TAB1蛋白條帶的光密度值，可知TAB1蛋白濃度由高到低依次為實(shí)驗(yàn)組一、、對(duì)照組一、實(shí)驗(yàn)組二和對(duì)照組二。
　　(3)四組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能表達(dá)TBK1蛋白，其中實(shí)驗(yàn)組一和對(duì)照組一的蛋白條帶較窄，實(shí)驗(yàn)組二和對(duì)照組二較寬。使用Quantity One圖像分析軟件分析TAB1蛋白條帶的光密度值，可以得出TBK

16、1蛋白濃度由高到低依次為實(shí)驗(yàn)組二、對(duì)照組二、對(duì)照組一和實(shí)驗(yàn)組一。
　　5.四組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-α的ELISA法檢測(cè)結(jié)果
　　(1) IL-6 OD450值，實(shí)驗(yàn)組一23.75±1.32，實(shí)驗(yàn)組二25.21±0.30，對(duì)照組一16.47±0.94，對(duì)照組二14.62±0.92。實(shí)驗(yàn)組二最高，與兩個(gè)對(duì)照組相比均存在顯著差異(P＜0.05)，但與實(shí)驗(yàn)組一不存在顯著差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組一與

17、兩個(gè)對(duì)照組同樣存在顯著差異(P＜0.05)。兩個(gè)對(duì)照組相比也存在顯著差異(P＜0.05)。
　　(2) IL-8 OD450值，實(shí)驗(yàn)組一1269.28±4.12，實(shí)驗(yàn)組二6022.64±134.71，對(duì)照組一66.26±11.56，對(duì)照組二127.26±4.49。實(shí)驗(yàn)組二最高，與其它三組均存在顯著的差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組一與兩個(gè)對(duì)照組均存在十分顯著的差異（P＜0.01）。CML-BMMSCs兩個(gè)對(duì)照組之間則無(wú)顯著差異（P＞0

18、.05）。
　　(3) TNF-α OD450值，實(shí)驗(yàn)組一32.17±0.83，實(shí)驗(yàn)組二36.33±7.03，對(duì)照組一50.79±4.01，對(duì)照組二44.17±3.09。對(duì)照組一最高，與對(duì)照組二無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但與兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組相比存在顯著的差異(P＜0.05)。對(duì)照組二與兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組也存在顯著性差異(P＜0.05)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　(4) IFN-α OD450值，實(shí)驗(yàn)組一27.7

19、3±2.83，實(shí)驗(yàn)組二40.11±0.61，對(duì)照組一37.93±1.86，對(duì)照組二53.66±4.29。對(duì)照組二最高，與其它三組比較均存在顯著性差異(P＜0.05)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組相比差異有顯著性(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組二與對(duì)照組一相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組一與對(duì)照組一相比存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　6.四組K562細(xì)胞β-catenin/β-actin mRNA表達(dá)值分別為:實(shí)驗(yàn)組一0.0130±0.0025

20、、實(shí)驗(yàn)組二0.0097±0.0020、對(duì)照組一0.0265±0.0042、對(duì)照組二0.0096±0.0027。其中，對(duì)照組一最高，與實(shí)驗(yàn)組一、實(shí)驗(yàn)組二及對(duì)照組二相比較均存在顯著差異(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組一、實(shí)驗(yàn)組二和對(duì)照組二兩兩相互比較差異性均不顯著(P＞0.05)。
　　7.β-catenin蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，四組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能表達(dá)β-catenin蛋白。采用Quantity One圖像分析軟件

21、分析β-catenin蛋白條帶的光密度值，得出β-catenin蛋白濃度由高到低依次為:對(duì)照組一、實(shí)驗(yàn)組一、實(shí)驗(yàn)組二和對(duì)照組二。
　　結(jié)論:
　　1.健康人來(lái)源的HMSC-hm對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，慢性髓系白血病患者來(lái)源的CML-BMMSCs不能抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　2.兩種BMMSCs對(duì)K562細(xì)胞的不同作用可能是通過(guò)調(diào)控Toll樣受體通路活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。HMSC-hm通過(guò)下調(diào)IL-6和IL-