抗肺癌單鏈抗體的構(gòu)建、表達、純化及初步活性鑒定.pdf

1、單鏈抗體是利用基因工程方法使抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段約5-25個aa的連接肽，首尾拼接而成的重組蛋白。本實驗所研究的抗肺癌單鏈抗體(LC-1single-chainFv，LC-1ScFv)是由抗肺癌雜交瘤細胞株(LC-1)分泌的單克隆抗體經(jīng)過基因改造得到的，是具有與抗原結(jié)合能力的最小抗體片段。目前，由于單鏈抗體的優(yōu)越性，它在許多腫瘤疾病的臨床診斷及免疫治療中已經(jīng)取得廣泛的應用，如體內(nèi)顯像、放射免疫治療、免疫毒素

2、治療等。本實驗的目的是利用基因工程技術獲得有活性的抗肺癌單鏈抗體。 本實驗從高分泌量和活力較高的抗肺癌雜交瘤單克隆細胞株中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設計引物從cDNA中PCR克隆出抗體的重鏈和輕鏈基因，克隆到T載體保存并測序，并且通過酶切鑒定。將重鏈和輕鏈基因經(jīng)重疊延伸PCR法構(gòu)建為單鏈抗體形式，回收并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。以上游引物Vsbak和下游引物Vsfor為引物，以T-ScFv'為模板PCR，對單鏈抗體基因進

3、行改造得到ScFv?；厥誔CR產(chǎn)物，酶切后連接于pET-22b(+)質(zhì)粒構(gòu)建成pET22-ScFv質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導后，重組蛋白得到高效表達而形成包涵體。抽提包涵體蛋白，得到較純的目的蛋白，通過蛋白復性技術使之復性，本文對復性條件進行了摸索。用Ni-NTA樹脂純化出目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析其純度，并初步分析目的蛋白活性。競爭ELISA實驗表明產(chǎn)物具有與天然抗體相近的活力。 本實驗成功地構(gòu)建了pE

4、T22-ScFv基因，然后利用大腸桿菌表達系統(tǒng)以包涵體的形式表達了pET22-ScFv蛋白，表達產(chǎn)物為分子量31kD左右的蛋白分子，與預期一致。大量表達目的蛋白，并對表達的蛋白質(zhì)進行了純化和復性，獲得了具有與天熱抗體相近活力的LC-1ScFv。 本實驗獲得了能夠與LC-1肺腺癌單抗相關抗原反應的ScFv，從而為其靶向診斷、治療及進一步基因工程改造奠定了基礎。此外，還可以應用基因工程技術得到ScFv融合蛋白，它和ScFv一樣能在各