柳樹AP3同源基因的克隆與表達分析.pdf

1、南京林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文柳樹AP3同源基因的克隆與表達分析姓名：關(guān)亞麗申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：林木遺傳育種指導(dǎo)教師：王明庥;黃敏仁20060601A b s t r a c tA P 3 p l a y s i m p o r t a n tr o l e si nf l o r a ld e v e l o p m e n t ．A sa B c l a s sg e n eo f “A B C ”m o d e l ，A P 3o

2、rP ／a n d A G c o n t r o lt h ed e v e l o p m e n t o fs t a l n e nt o g e t h e r ．Ap a i ro f p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n g t Op u b l i s h e d P o p u l u s t r i c h o c a r p ag e n e ( P

3、T D ) ，a n da n2 ．1 Kf r a g m e n tw a sa m p l i f i e d( P C R ) b y u s i n g t h eg e n o m i c D N A o fS a l i x ．B a b y l o n i c a ，S a l i x , c a p r e a ，S a l i x ．a(chǎn) l b a f , S a l i x ．i n t e g r a ,S a

4、l i x ．e r i o c l a d aa n d S a l 及．s u c h o w e n s i s r e s p e c t i v e l y ．B yu s i n g5 ’R A C Ea n d3 ’R A C Et e c h n i q u e ．t h eh o m o l o g u eA P 3 g e n ew a s o b t a i n e di nt h eS ．s u c h o w

5、e n s i s ．T h ec o m p l e t e dc D N A s e q u e n c eW a s8 2 6 b pa n d e n c o d e d f o ra p o l y p e p t i d eo f2 4 1 a m i n o a c i d s ，2 8 K Dm o l e c u l a r w e i g h t ．A c c o r d i n g t Ot h e t h ef

6、o i l —l e n g t he D N A o f S ．s u c h o w e n s i sa n d t h e g e n o m i c D N A s e q u e n c e s ，t h e f u l l —l e n g t h c D N A s e q u e n c e s o f h o m o l o g u e A P 3 i n S ．b a b y l o n i c a ，S ．c a

7、 p r e a ,S ．a(chǎn) l b a f S ．i n t e g r aa n d S ．e r i o c l a d aw e r ep r e d i c t e d ．T h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eh o m o l o g u e A P 3g e n e s o f S a l i x w e r e h J I g h c o n s e r v a t

8、i v e ．w i t h 9 5 ％- 9 8 ．7 ％i d e n t i t y o f n u c l e o t i d e s a n d9 5 ．2 ％一9 9 ．6 ％o f p r o t e i n s ．T od e t e r m i n e t h e e x p r e s s i o np a t t e m o f S S M A D Sd u r i n g t h ep l a n td e v

9、e l o p m e n ti n s ．s u c h o w e n s i s ，r e a lt i m eR T - P C R t e c h n i q u eW a s a p p f i e d ．T h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ee x p r e s s i o no fS S M A D S i nt r a n s c r i p tl e v e l s ，

10、i nd i f f e r e n to r g a n sa n d a td i f f e r e n td e v e l o p —m e n ts t a g e s ，w a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ，w i t hv e r yl o w e x p r e s s i o n i nt h el e a f , s h o o ta n d r o o

11、ta n d h i g h e x p r e s s i o ni nf l o r a lo r g a n ，a n d i n c r e a s e da tt h ee a r l y d e v e l o p m e n ts t a g eb u t d e c r e a s e da tt h el a t es t a g eo ff l o r a lo r g a n s ．W e i n t r o d

12、u c e dt h e p l a n te x p r e s s i o nv e c t o rw i t ht h eO s M A D S l 6 g e n et OA g r o b a —c 胞H u mt u m e f a c i e n sE H A l 0 5 ．T h e nt h e t o b a c c ow a st r a n s f o r m e db yt h e m e t h o d &#

13、183;o ft h e l e a fd i s ct r a n s f o r m a t i o n ，a n d9 5h y g r o m y c i n —r e s i s t a n tb u d sw e r eo b t a i n e d ．W h e n t h eb u d w a s m o r et h a n1 ．5 c e n t i m e t e r s ，i tw a sc u ta n dt

14、r a n s f e r r e di n t o M S m e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h h y 薩o m y c i n5 0 m g ／L ．A f t e r2 0d a y s ，t h em a j o r i t yo ft h ey o u n g s h o o t sc o u l d r o o tn o r m a l l y ．2 0i n d i v i

15、d u a l sw h i c h c o u l d r e s i s th y g m m y c i n w a s t e s t e db y P C R ，a n d1 8o f t h e m w e r ep o s i t i v e ．W e e s t a b l i s h e dt h et r a n s g e n e t i cs y s t e mo f 墨s u c h o w e n s i s

16、 ．T h ei n f l u e n c eo f e l e m e n t a r ym e d i u m a n dt h eh o r m o n e c o m b i n a t i o n o n s h o o t s i n d u c t i o n w a ss t u d i e d ，b u t e l e m e n t a r ym e d i u m h a d t i t t l e i n f

17、l u e n c eo ni t ．T h eb e s th o r m o n ec o m b i n a t i o nw a sB A 1 ．0 m g ／La n dN A A0 ．0 1 m g ／L ，f r o mw h i c ht h er a t e o fs h o o t s —r e g e n e r a t e dw a s1 0 0 ％a n dt h ea v e r a g en u m b e

18、 ro fs h o o ti n d u c t i o nw a s3 ．W h e nr e g e n e r a t e ds h o o tW a sa sh i g ha s3c e n t i m e t e r s ，i tw a sc u ta n dt r a n s f e r r e di n t oW h i t e o rB 5e l e m e n t a r ym e d i u mw i t hn o