β-catenin干涉質(zhì)粒對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 積極探索膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，探索有效治療方法一直以來(lái)是神經(jīng)外科最重要，最熱點(diǎn)的研究課題之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路與腦腫瘤的生長(zhǎng)有密切關(guān)系。為了調(diào)節(jié)在腦腫瘤中異常表達(dá)的發(fā)育相關(guān)信號(hào)分子抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)最大限度的降低對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，有必要對(duì)發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行更加全面和深入的研究。Wnt信號(hào)通路在不同種屬的發(fā)育、細(xì)胞分化與增殖中起重要作用，而且發(fā)現(xiàn)它參與某些腫瘤的形成。Wnt/β-catenin信號(hào)

2、通路被認(rèn)為是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，異常Wnt信號(hào)通路致癌的關(guān)鍵是胞內(nèi)游離的β-catenin蛋白積累并進(jìn)入細(xì)胞核。β-catenin蛋白的聚集表達(dá)與腫瘤的侵襲，轉(zhuǎn)移和預(yù)后都有密切的關(guān)系。因此有學(xué)者認(rèn)為針對(duì)Wnt信號(hào)通路的靶向治療可以抑制腫瘤的形成和生長(zhǎng)。我們課題組前期收集94例各個(gè)級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織和6例正常腦組織通過(guò)免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)β-catenin基因在膠質(zhì)瘤中比正常腦組織中明顯表達(dá)增高，并且隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增高而增高。因此我們認(rèn)

3、為β-catenin是一個(gè)比較理想膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)標(biāo)記和基因治療靶點(diǎn)。本研究擬運(yùn)用RNA干涉技術(shù)構(gòu)建靶向β-catenin基因的RNA干涉質(zhì)粒，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，對(duì)該基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程中的影響進(jìn)行深入研究，以期望為膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和靶向治療途徑。 方法： 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，通過(guò)軟件設(shè)計(jì)與參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取含有19個(gè)核苷酸靶序列的一條反向重復(fù)序列，間以9個(gè)核苷酸的莖環(huán)序列

4、，兩端分別加上對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo載體中，獲得靶向抑制β-catenin基因表達(dá)的干涉質(zhì)粒。經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定。用脂質(zhì)體介導(dǎo)該干涉質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR、Western blotting方法檢測(cè)β-catenin基因mRNA、蛋白表達(dá)水平的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)RNA干涉的效果。觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的變化，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)初步評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后對(duì)U251細(xì)胞的

5、生物學(xué)影響。 結(jié)果： 成功構(gòu)建針對(duì)靶向β-catenin基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin RNA干涉質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定為目的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251后β-catenin干涉質(zhì)粒有效的抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中β-catenin基因mRNA水平、蛋白水平的表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)48小時(shí)以后胞核內(nèi)出現(xiàn)一些空泡，隨時(shí)間增加細(xì)胞增殖變慢，死亡細(xì)胞逐漸增多，出現(xiàn)破碎、崩解等壞死表現(xiàn)，漂浮細(xì)胞及

6、細(xì)胞周圍碎片增多，呈明顯的時(shí)間依賴性。MTT提示轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質(zhì)粒后細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，各時(shí)間段轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質(zhì)粒組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比明顯受到抑制(P<0.01)。轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質(zhì)粒組U251細(xì)胞的增殖隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸升高，且在作用72小時(shí)時(shí)抑制率較高，另

7、外空白對(duì)照組和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示pGFP[Neo-shRNA-β-catenin質(zhì)粒72小時(shí)后的U251細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組和陰性質(zhì)粒對(duì)照組比較明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。FCM檢測(cè)細(xì)胞周期顯示轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質(zhì)粒與空白對(duì)照組細(xì)胞周期變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞大多聚集在G0/G1期，而S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)目

8、顯著下降，處于DNA復(fù)制和活動(dòng)的細(xì)胞數(shù)目減少，U251細(xì)胞增殖受到抑制。 結(jié)論： 靶向β-catenin基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin RNA干涉質(zhì)粒構(gòu)建成功，并可特異性的沉默β-catenin基因的表達(dá)，初步證明了轉(zhuǎn)染β-catenin干涉質(zhì)粒促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，抑制了細(xì)胞分化和增殖。膠質(zhì)瘤惡性生長(zhǎng)過(guò)程與Wnt信號(hào)通路β-catenin的激活有密切關(guān)系，β-catenin是一個(gè)比較理想膠質(zhì)