表達NT4-SAC-HA2-TAT融合肽的重組腺伴隨病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、研究背景及目的： 前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率迅速增加。雄激素阻斷療法是前列腺癌各個階段最主要的治療手段之一。但是，多數(shù)前列腺癌在平均12～18個月后逐漸對雄激素阻斷療法失去反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔A后差。前列腺凋亡反應(yīng)基因-4（prostate apoptosis response-4gene，par-4）是近來發(fā)現(xiàn)的一個促凋亡基因，其核心區(qū)凋亡肽（SAC）不需考慮癌細胞是否存在對Par-4

2、敏感或抵抗，對激素依賴性和非激素依賴性前列腺癌細胞都能產(chǎn)生凋亡誘導效應(yīng)。我們構(gòu)建了SAC表達載體，同時引入了信號肽神經(jīng)營養(yǎng)因子-4（neurotrohphin-4，NT4）及穿膜肽TAT，并進一步構(gòu)建分泌NT4-SAC-HA2-TAT融合肽的重組腺伴隨病毒，為探討Par-4核心結(jié)構(gòu)域SAC作為目的基因?qū)η傲邢侔┑闹委熥饔玫於嘶A(chǔ)。 方法： 1．設(shè)計合成SAC的正向和反向引物，應(yīng)用互為引物模板法合成具有NaeⅠ和KpnⅠ

3、酶識別位點的SAC cDNA片段。將該片段克隆到pGEM-T easy中，轉(zhuǎn)化細菌篩選陽性克隆，酶切鑒定，序列測定分析。 2．NaeⅠ和KpnⅠ酶切pGEM-T-SAC，將所得SAC和已有HA2-TAT片段克隆到具有相應(yīng)酶切位點的pBV220/NT4質(zhì)粒，得到pBV220-NT4-SAC-HA2-TAT重組質(zhì)粒。PCR擴增以EcoRⅠ、HindⅢ酶切上述質(zhì)粒獲取的NT4-SAC-HA2-TATcDNA片段，并將其克隆到pGEM-

4、T easy中，轉(zhuǎn)化細菌篩選陽性克隆，酶切鑒定，序列測定分析。 3．將NT4-SAC-HA2-TAT融合基因片段插入具有相應(yīng)酶切位點的pSSCMV病毒載體質(zhì)粒，得到重組腺伴隨病毒載體質(zhì)粒。 4．將已構(gòu)建的重組腺伴隨病毒載體質(zhì)粒、腺病毒輔助質(zhì)粒PFG140和包裝質(zhì)粒pAAV/Ad三質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293細胞系，通過同源重組獲得NT4-SAC-HA2-TAT重組腺伴隨病毒載體，收集病毒，斑點雜交（Dot blot）法測

5、定病毒滴度。 結(jié)果： 1．SAC基因經(jīng)DNA測序與Genebank序列一致。 2．NT4-SAC-HA2-TAT融合基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確。 3．酶切鑒定證實已將NT4-SAC-HA2-TAT融合基因成功轉(zhuǎn)至PSSCMV載體中；斑點雜交測定重組腺伴隨病毒的滴度約為3．42×1010 PFU/ml～3．42×1011PFU/ml。 結(jié)論： 1．成功克隆Par-4核心結(jié)構(gòu)域SAC基因。