H0-1基因轉(zhuǎn)染預(yù)防慢性移植腎病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、器官移植是腎臟，胰島，或心臟等慢性終末期疾病的主要治療方法。雖然免疫抑制劑的進(jìn)步使移植物特別是移植腎急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率能夠得到較好的控制，但移植物長期生存率并沒有明顯改善，這主要?dú)w結(jié)于移植物慢性失功。盡管具體的分子和細(xì)胞機(jī)制尚不清楚，但目前可以肯定非免疫因素和免疫因素在慢性移植物功能障礙的發(fā)病機(jī)理中都起重要作用。 血紅素氧化酶(HemeOxygenase,HO)是降解亞鐵血紅素為一氧化碳、膽綠素、亞鐵離子的胞內(nèi)限速酶。HO有三

2、個(gè)亞型(HO-1，-2and-3)，其中HO-3結(jié)構(gòu)和功能與HO-2相似，為HO的組成型，HO-1為誘導(dǎo)型，能在多種細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，主要分布于脾、肝臟、骨髓等單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。許多應(yīng)激相關(guān)的刺激能夠誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，而HO-1的細(xì)胞保護(hù)作用與它的3種代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。其中有明顯的抗炎活性的CO研究最多。在既往的動(dòng)物模型研究中，HO-1能分別減輕移植物缺血/再灌注損傷和急性移植物排斥反應(yīng)；在抗CD4單抗誘導(dǎo)同種異體移植物長期存活的動(dòng)物模

3、型中，移植后早期誘導(dǎo)HO-1表達(dá)能夠改善抗體相關(guān)移植物動(dòng)脈硬化。 慢性移植腎病(ChronicAllograftNephropathy，CAN)，是移植腎功能慢性失功的統(tǒng)稱，現(xiàn)公認(rèn)非免疫因素的缺血再灌注損傷和免疫因素的排斥反應(yīng)是影響移植腎長期存活的最重要兩大因素。我們在HO-1分別具有抗缺血再灌注損傷和抗排斥反應(yīng)類似保護(hù)基因作用的文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，推測其在局部高表達(dá)可以同時(shí)減輕缺血損傷和排斥反應(yīng)，應(yīng)對CAN的發(fā)生發(fā)展過程起到延緩的作用

4、。因而本研究中我們使用HO-1重組腺病毒將HO-1基因?qū)牍┠I中，觀察HO-1能否預(yù)防慢性移植腎病的發(fā)生發(fā)展。 目的1.構(gòu)建Ad-HO-1重組腺病毒載體，并鑒定其安全性及生物活性； 2.將Ad-HO-1重組腺病毒載體感染腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，探討Ad-HO-1感染靶細(xì)胞的效率、目的基因表達(dá)產(chǎn)物水平及在體外對刺激人單個(gè)核細(xì)(PBMC)增殖能力的影響。 3.通過建立大鼠慢性移植腎病模型，觀察Ad-HO-1在體灌

5、注移植腎后的轉(zhuǎn)染效率及其蛋白表達(dá)情況，通過Ad-HO-1在體灌注將HO-1基因?qū)氪笫竽I臟移植物，探討HO-1基因轉(zhuǎn)染對慢性移植腎病的預(yù)防作用。 方法本實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行：一、Ad-HO-1重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ+HindⅢ從克隆載體PRH01中切出HO-1基因片段，亞克隆至經(jīng)SalⅠ+HindⅢ酶切的克隆質(zhì)粒Puc18中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒Puc18-PRH01，將之用KpnⅠ+HindⅢ雙酶切，再次亞克隆至

6、經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-Puc18-PRHO1，將之PmeⅠ酶切線性化后與腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，在BJ5183菌種中進(jìn)行同源重組，得到腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-HO-1，經(jīng)293細(xì)胞包裝后，擴(kuò)增、濃縮，最終獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)HO-1基因腺病毒Ad-HO-1。通過PCR、基因測序進(jìn)行鑒定。 二、Ad-HO-1的細(xì)胞毒性和介導(dǎo)HO-1基因表達(dá)能

7、力的檢測用Ad-HO-1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染非包裝的HK-2細(xì)胞后，對HK-2形態(tài)和生長無明顯影響，表明Ad-HO-1安全可靠，細(xì)胞毒性小。熒光顯微鏡直接觀察GFP在上述細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果37℃下Ad-HO-1轉(zhuǎn)染該細(xì)胞GFP陽性表達(dá)率達(dá)90％以上；以WesternBlot檢測Ad-HO-1轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞，結(jié)果顯示有HO-1蛋白條帶，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相應(yīng)位置無此條帶，表明Ad-HO-1可轉(zhuǎn)染非包裝細(xì)胞并表達(dá)目的蛋白，進(jìn)一步證明載體構(gòu)建正確

8、。通過感染腺病毒的HK-2細(xì)胞與人外周血單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)顯示Ad-HO-1能夠在體外有效的降低T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。 三、Ad-HO-1對大鼠慢性移植腎病的預(yù)防作用采用在體灌注的方法實(shí)現(xiàn)了Ad-HO-1對移植腎的有效轉(zhuǎn)染。冰凍切片觀察GFP熒光主要在腎小管和間質(zhì)部位，腎小球轉(zhuǎn)染率低?；蜣D(zhuǎn)染供體腎后行F344-LEW腎移植顯示：腎臟HO-1于移植后第3天即有表達(dá)，轉(zhuǎn)染后1～2周表達(dá)最強(qiáng)。腎移植術(shù)后16周移植腎病理Banff評分及免疫

9、組化結(jié)果顯示：HO-1的基因轉(zhuǎn)染能減緩移植腎的腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，對大鼠慢性移植腎病具有一定的預(yù)防作用。 結(jié)論1.采用DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad-HO-1； 2.經(jīng)PCR、熒光顯微鏡等檢測表明：重組腺病毒Ad-HO-1能高效、穩(wěn)定的表達(dá)HO-1目的基因和具有良好的安全性； 3.在體外功能試驗(yàn)中，感染腺病毒的腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)不僅生長形態(tài)狀況無顯著變化，而且在腺病毒感染HK-2平均感

10、染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01、O.1時(shí)對人外周血單8個(gè)核細(xì)胞的增殖反應(yīng)具有顯著的抑制作用，提示HO-1可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活和增殖的方式抑制移植物排斥反應(yīng)。 4.在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對供腎在體原位灌注Ad-HO-1，檢測發(fā)現(xiàn)移植腎腎小管第3天有目的蛋白表達(dá)，且持續(xù)2～4周，在體基因灌注具有較高的轉(zhuǎn)染效率。 5.Ad-HO-1轉(zhuǎn)染移植腎后，移植腎α-SMA、TGF-β及PDGFB表達(dá)減低，腎臟病理損傷及移植腎纖維化減輕，移植腎