Klotho基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療慢性心衰大鼠心肌重構(gòu)的實驗研究.pdf

1、目的：探討以重組慢病毒為載體介導(dǎo) Klotho基因（抗衰老基因）修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow Mesenchymal stem cells,BMSCs）對大鼠心力衰竭（心衰）進(jìn)程及心肌重構(gòu)的影響，并探討其機制。
　　方法：全骨髓貼壁培養(yǎng)法體外分離、培養(yǎng)、擴增 SD大鼠 BMSCs，通過觀察 BMSCs細(xì)胞形態(tài)及生長增殖特性、細(xì)胞表面抗原，成脂及成骨誘導(dǎo)分化鑒定BMSCs并獲取第3-5代BMSCs；以重組慢病毒為載

2、體將KLotho基因轉(zhuǎn)染至大鼠BMSCs，用RT-PCR鑒定目的基因Klotho的mRNA的表達(dá)，獲取Klotho基因修飾的BMSCs。清潔級SD大鼠，體重250-300g，腹腔連續(xù)注射異丙腎上腺素建立心衰大鼠模型。造模6周后按隨機數(shù)表法分為3組，即 EGFP-Klotho-BMSCs組（在心衰模型基礎(chǔ)上，尾靜脈注射 Klotho基因修飾的 BMSCs），EGFP-BMSCs組（在心衰模型基礎(chǔ)上，尾靜脈注射空載慢病毒轉(zhuǎn)染的 BMSCs）

3、，生理鹽水組（在心衰模型基礎(chǔ)上，尾靜脈注射與前者等體積生理鹽水），用上述三組與正常組作對照研究。細(xì)胞移植治療4周后，稱取大鼠體重并處死大鼠，稱取心臟標(biāo)本計算心臟濕重/體重指數(shù)（HW/BW），伊紅-蘇木素（Hematoxylin Eosin, HE）染色觀察心肌組織病理變化，Masson染色觀察膠原纖維的表達(dá)，TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡率，在熒光顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，RT-PCR反應(yīng)評估各組大鼠心肌組織中 K

4、lotho基因以及心肌纖維化相關(guān)因子 I型膠原（ CollagenI）和Ⅲ型膠原(CollagenⅢ)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、全骨髓貼壁法培養(yǎng)的原代BMSCs48小時后可見少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞伸展成梭形、多角形，細(xì)胞生長旺盛；生長曲線顯示 BMSCs符合正常細(xì)胞生長特征且生長活躍，經(jīng)歷生長潛伏期、對數(shù)生長期、生長平臺期；流式細(xì)胞儀檢測顯示第三代 BMSCs表達(dá) CD90、CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物 CD34，符合 BMSC

5、s特征；成脂及成骨誘導(dǎo)后，油紅 O染色、茜素紅染色陽性，表明 BMSCs具有體外向成脂、成骨誘導(dǎo)分化的能力。2、以重組慢病毒為載體成功將Klotho基因轉(zhuǎn)染到 BMSCs，熒光顯微鏡下第4天的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)70％-80%以上，并且至第7天呈持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。3、RT-PCR結(jié)果表明與BMSCs組及EGFP-BMSCs組比較，EGFP-Klotho-BMSCs組的 BMSCs中 Klotho基因表達(dá)明顯增多（P<0.05）。3、干細(xì)胞移植4周

6、后，EGFP-Klotho-BMSCs組和 EGFP-BMSCs組大鼠心肌組織中仍可見 EGFP綠色熒光表達(dá)，且 EGFP-Klotho-BMSCs組心肌組織中綠色熒光表達(dá)數(shù)量較 EGFP-BMSCs組顯著增多，提示轉(zhuǎn)染 Klotho基因組干細(xì)胞存活率顯著增加。4、心衰組大鼠較正常組大鼠出現(xiàn)體重減輕、攝食飲水減少、呼吸急促、心率增快、精神萎靡等心衰癥狀，但 EGFP-BMSCs組和 EGFP-Klotho-BMSCs組大鼠在細(xì)胞移植治療

7、4周后其心衰癥狀較生理鹽水組明顯改善，其中 EGFP-Klotho-BMSCs組大鼠改善最為明顯。5、生理鹽水組、EGFP-BMSCs組和 EGFP-Klotho-BMSCs組大鼠心重指數(shù)（HW/BW）均明顯高于正常組（P<0.01）,但 EGFP-Klotho-BMSCs治療組 HW/BW明顯低于 EGFP-BMSCs組及生理鹽水組（P<0.01），EGFP-BMSCs組亦低于生理鹽水組（P<0.01）。6、生理鹽水組、EGFP-BM

8、SCs組和 EGFP-Klotho-BMSCs組大鼠心肌組織 HE染色、MASSON染色可見心肌細(xì)胞肥大及壞死、心肌纖維斷裂、心肌間質(zhì)纖維化瘢痕組織形成、心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，正常組大鼠心肌組織未見上述病理改變。提示 EGFP-Klotho-BMSCs組大鼠心肌纖維化程度、心肌細(xì)胞變性壞死程度即心臟重構(gòu)程度均較生理鹽水組、EGFP-BMSCs組輕,而EGFP-BMSCs組心肌纖維化重構(gòu)程度又較生理鹽水組輕。7、生理鹽水組、EGFP-BMSC

9、s組、EGFP-Klotho-BMSCs組心肌細(xì)胞凋亡率均較正常組高（P<0.01），EGFP-BMSCs組介于 EGFP-Klotho-BMSCs組、生理鹽水組之間，EGFP-Klotho-EGFP組凋亡率降低最明顯（P<0.01）。8、RT-PCR檢測結(jié)果顯示各組大鼠心肌組織中Klotho、膠原Ⅰa1和Ⅲa1 mRNA均有表達(dá)。其中，正常組、EGFP-BMSCs組和EGFP-Klotho-BMSCs組Klotho mRNA表達(dá)水平較

10、高，與生理鹽水組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P<0.05），而 EGFP-Klotho-BMSCs組Klotho mRNA表達(dá)水平較正常組、EGFP-BMSCs組亦高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但正常組與EGFP-BMSCs組無統(tǒng)計學(xué)意義。正常組、EGFP-BMSCs組、EGFP-Klotho-BMSCs組 Collagen I mRNA、CollagenⅢ mRNA的表達(dá)水平均較生理鹽水組低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0

11、5），而 EGFP-Klotho-BMSCs組、EGFP-BMSCs組、正常組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。9、經(jīng)相關(guān)分析顯示大鼠心肌組織Klotho mRNA表達(dá)量與心肌組織CollagenImRNA、CollagenⅢmRNA的表達(dá)量呈獨立、顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,與心肌膠原容積比成負(fù)相關(guān)（r=-0.516， P>0.05），與心肌細(xì)胞凋亡率呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（ r=-0.578， p<0.05；r=-0.558， p<0.05；