胚胎后腎間充質(zhì)細胞移植治療阿霉素慢性腎病大鼠的實驗研究.pdf

1、目的：研究胚胎后腎間充質(zhì)細胞(metanephric mesenchymal cells，MMCs)尾靜脈移植對阿霉素(Adriamycin，ADR)慢性腎病大鼠損傷腎臟的再生修復(fù)作用及其可能機制。 方法： 1.大鼠胚胎后腎間充質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。取孕13天大鼠胚胎，分離胚胎腎臟，去除輸尿管芽，消化后置37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞，并行HE染色、電鏡觀察、生長曲線測定；A

2、BC免疫酶染色法檢測波形蛋白、角蛋白、nestin、CD133、CD34；直接免疫熒光法檢測雙花扁豆凝集素(Dolichos Biflorus，DB)，并流式細胞術(shù)定量檢測。 2.大鼠胚胎后腎間充質(zhì)細胞的體外標記方法探討。分別將4’，6-二脒-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、DAPI體外標記MMCs、綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)

3、體外標記MMCs，通過尾靜脈注入阿霉素腎病大鼠體內(nèi)；于細胞移植后1w、3w、5w行腎組織冰凍切片，觀察DAPI及GFP熒光分布，并ABC免疫酶染色法檢測腎組織中GFP表達。 3.從細胞分化的角度，探討尾靜脈細胞移植對阿霉素腎病大鼠的修復(fù)改善作用。(1)分別以含阿霉素腎病大鼠血清及腎組織勻漿的培養(yǎng)基，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后腎間充質(zhì)細胞，采用細胞免疫化學(xué)方法檢測細胞角蛋白(cytokeratin，CK)、角蛋白-18(cytokeratin

4、-18，CK-18)、波形蛋白、維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)表達。(2)通過尾靜脈注射移植GFP標記MMCs至阿霉素腎病大鼠，CK及GFP雙標記觀察MMCs的歸巢及分化情況。(3)檢測阿霉素大鼠細胞移植前后24小時尿蛋白定量、24小時尿肌酐定量、血清白蛋白、總膽固醇、尿素氮、肌酐、腎小管損傷指數(shù)及腎小球硬化面積等指標，并計算內(nèi)生肌酐清除率，了解MMCs對腎功能的影響。 4.探討胚胎后腎間充質(zhì)細胞移

5、植對阿霉素腎病大鼠的治療作用。90只體重200～220.Sprague-Dawley大鼠隨機分成3組：阿霉素腎病組(ADR group，n=40)：采用阿霉素二次注射法，間隔3周，每次劑量為0.25 mg/10.g體重；MMCs細胞移植組(ADR-MMCs group，n=40)：于第二次阿霉素注射后8周，尾靜脈注入MMCs，劑量為每只大鼠5～7×106；正常對照組(control group，n=10)。于阿霉素注射后16周殺鼠，留取

6、標本行血、尿生化檢測、腎組織病理學(xué)分析，免疫組化法檢測腎組織IV型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，NMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表達，并Western blot及RT-PCR進一步檢測腎組織MMP-2、MMP-9的蛋白及基因定量。 結(jié)果： 1.MMCs形態(tài)為成纖維細胞樣，貼壁生長，48～72小時達生

7、長高峰；波形蛋白、nestin、CD133表達陽性；角蛋白、CD34、DB表達陰性；MMCs以DB標記后流式細胞檢測為單峰。 2.(1)DAPI標記細胞及單純DAPI尾靜脈注射后1周，均可在腎小管上皮細胞中觀察到DAPI陽性細胞，至移植后5周仍可觀察到，但隨時間延長熒光有減弱趨勢。(2)GFP標記細胞移植后1周，可在腎小管上皮細胞中觀察到GFP陽性細胞，至移植后5周仍可觀察到，熒光無明顯減弱。(3)ABC免疫酶染色法檢測，顯示G

8、FP陽性細胞主要表達于近端腎小管中，腎小球系膜區(qū)亦可觀察到少量表達；GFP陽性產(chǎn)物主要表達于胞漿。GFP表達半定量評分顯示，標記細胞的早期應(yīng)用陽性率大于晚期應(yīng)用者，且隨觀察時間延長，陽性率有升高趨勢。 3.(1)MMCs在阿霉素腎病大鼠血清及勻漿體外誘導(dǎo)培養(yǎng)下，均可檢測到CK-18、VDR陽性表達。(2)GFP標記MMCs移植后1周，于阿霉素腎病大鼠腎小管及腎小球中，均可檢測到GFP、CK雙標記陽性細胞。(3)阿霉素腎病大鼠MM

9、Cs移植后，內(nèi)生肌酐清除率提高，但其它指標檢測(24小時尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、腎小管損傷指數(shù)及腎小球硬化面積)與細胞移植前比較，均無顯著性差異。另外，血尿素氮、肌酐在阿霉素作用前后無顯著性差異。 4.與阿霉素組比較，細胞移植組大鼠腎組織IV型膠原沉積減少、MMP-2蛋白表達下調(diào)、MMP-9蛋白表達升高，并有顯著性差異(P<0.05)；相關(guān)分析顯示，IV型膠原沉積與MMP-2蛋白表達存在正相關(guān)，而與MMP-9蛋白表達呈

10、負相關(guān)(P<0.05)；血、尿生化指標檢測同第三部分類似，細胞移植組與阿霉素組在24小時尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、腎小管損傷指數(shù)及腎小球硬化面積檢測上，均無顯著性差異。另外，血尿素氮、肌酐在大鼠阿霉素作用前后無顯著性差異。 結(jié)論： 1.培養(yǎng)細胞為后腎間充質(zhì)細胞，純度及穩(wěn)定性較高并符合干細胞特征。 2.MMCs的脂質(zhì)體感染法GFP標記，是一便捷、有效的體外標記方法，適于移植細胞的短期內(nèi)示蹤、觀察，并可為其它