應(yīng)用磁性納米顆粒介導(dǎo)人源化轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白重編程廣西巴馬小型豬耳成纖維細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)的研究.pdf

1、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stemcells,iPSCs）來源于體細(xì)胞的重編程，與胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）相比具有很大的優(yōu)越性：無需破壞胚胎，可完全避免倫理之爭。然而，截至目前，iPSCs的研究尚存在幾大難題：1）安全性差；2）效率低；3）耗時長。鑒于此，本研究引入了磁性納米技術(shù)，旨在建立一種安全性高、效率可觀、耗時較短的獲取iPSCs的新方法。首先，將四個人源化轉(zhuǎn)

2、錄因子基因（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）分別整合入四個pEGFP-N1載體，形成四種重組質(zhì)粒，然后利用聚乙烯亞胺（Po lyether imid e,PEI）表面修飾后的磁性納米顆粒（Poly-MAG）與其偶聯(lián)，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以表達(dá)四個重組蛋白，再通過G418篩選陽性克隆并增殖培養(yǎng)，然后提取于純化陽性細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白。并再次利用 Poly-MAG與這些重組蛋白結(jié)合，提高其導(dǎo)入體細(xì)胞的效率，在這些重組蛋白進(jìn)入廣西巴馬

3、小型豬耳成纖維細(xì)胞以后發(fā)揮重編程逆轉(zhuǎn)化的作用，以獲得iPSCs。應(yīng)用此方法可以避免因病毒轉(zhuǎn)染以及引入外源基因而導(dǎo)致的致瘤風(fēng)險。與單純利用細(xì)胞穿膜肽（Cell penetrating peptides,CPPs）技術(shù)介導(dǎo)重組蛋白進(jìn)入被誘導(dǎo)體細(xì)胞發(fā)生重編程的方法相比較，應(yīng)用與磁性納米技術(shù)相結(jié)合誘導(dǎo)出現(xiàn)iPSCs的時間更短、效率更高。主要研究結(jié)果如下：
　　試驗一：廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細(xì)胞的分離方法及培養(yǎng)體系優(yōu)化
　　為了挑選

4、生長性能良好的廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行重編程逆轉(zhuǎn)化試驗，本研究采用5種不同方法（4種酶消化法和1種組織塊培養(yǎng)法）分離成纖維細(xì)胞，通過比較細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞死亡率，篩選出適宜的分離方法，并比較了小型豬不同部位（耳部、腿部、腹部、背部和尾部）皮膚組織獲取成纖維細(xì)胞的差異性。結(jié)果表明：
　?。?）采用先加0.25％胰蛋白酶消化30min，再加0.2%膠原蛋白酶消化30min的方法所獲成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他處理組（p＜0.

5、05），死亡率與0.125%胰酶消化60min處理組之間差異不顯著（p＞0.05），但顯著低于其他酶消化處理組（p＜0.05）；
　?。?）利用組織塊培養(yǎng)法，4天后即可從組織塊邊緣長出成纖維細(xì)胞，去除組織塊后，經(jīng)過5天，細(xì)胞匯合率可達(dá)80%，與酶消化法（細(xì)胞匯合率達(dá)80%僅耗時2天）相比，耗時更長；
　?。?）五個不同部位皮膚中，以耳部皮膚獲得細(xì)胞數(shù)最多，培養(yǎng)后貼壁效果最好；
　?。?）所得耳皮膚成纖維細(xì)胞可傳至10代

6、以上，其中第3代和第4代細(xì)胞的活力最強；
　?。?）豬耳成纖維細(xì)胞生長曲線顯示，細(xì)胞在接種培養(yǎng)后的0~3d內(nèi)處于生長潛伏期，而在3~8d內(nèi)細(xì)胞呈對數(shù)生長，8d后細(xì)胞進(jìn)入生長平臺期，10d后細(xì)胞貼壁能力下降，呈現(xiàn)負(fù)增長。因此，宜選用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化30min，再加0.2%膠原蛋白酶消化30min的方法分離豬耳皮膚成纖維細(xì)胞，取培養(yǎng)3~8d的第3代或第4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)重編程試驗。
　　試驗二：三種轉(zhuǎn)染試

7、劑介導(dǎo)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)入293T細(xì)胞的條件優(yōu)化
　　本試驗旨在探討脂質(zhì)體2000（Lipofectamine?2000）、PEI和Poly-MAG這三種轉(zhuǎn)染試劑在結(jié)合含Oct4基因的pEGFP-N1質(zhì)粒后向293T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率差異性。試驗先將所提質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定及瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后，分別采用不同濃度的上述三種轉(zhuǎn)染試劑與不同濃度的重組有Oct4基因的pEGFP-N1偶聯(lián)，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以pEGFP-N1載體自帶的綠色熒

8、光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）基因做報告基因，通過統(tǒng)計各個濃度的轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞存活率，篩選出轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小的一種轉(zhuǎn)染試劑及其最佳工作濃度。最后通過G418對轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞進(jìn)行陽性克隆篩選，經(jīng)增殖培養(yǎng)后提取和純化重組蛋白，測定其濃度，并通過SDS-PAGE檢測其純度。本試驗還采用普魯士藍(lán)染色法對293T細(xì)胞內(nèi)的磁性氧化鐵納米顆粒進(jìn)行了定性檢測。結(jié)果表明：
　?。?）四個轉(zhuǎn)錄因子基因

9、（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）重組質(zhì)粒濃度分別為：（299ng/μL、492ng/μL、500ng/μL和481ng/μL），DNA電泳條帶全部吻合，且純度高。
　?。?）Poly-MAG、Lipofectamine?2000、PEI三種轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)含Oct4的重組質(zhì)粒進(jìn)入293T細(xì)胞的適宜濃度分別為：10μg/mL（磁板作用20min）、5μg/mL和40μg/mL，其轉(zhuǎn)染效率分別為64.09±0.53%、63.8

10、2±2.53%和30.20±2.28%。Poly-MAG（10μg/mL，磁板作用20min）處理組的細(xì)胞存活率極顯著高于PEI（40μg/mL）處理組和Lipofectamine?2000（5μg/mL）處理組，（91.75±0.62%vs60.40±3.66%，31.10±5.58%，p<0.01）。
　　（3）在陽性克隆的篩選試驗中，當(dāng)G418濃度600μg/mL和700μg/mL時，陽性克隆率分別為（86.54±2.35%

11、vs90.00±1.49%），二者差異不顯著，但均顯著高于其他處理組，（p<0.05）。
　?。?）四種重組蛋白（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）純化后濃度分別為：（461μg/mL，434μg/mL，615μg/mL，787μg/mL），通過SDS-PAGE檢測，可見目的蛋白條帶清晰，純度高。
　?。?）在普魯士藍(lán)染色試驗中，10μg/mL Poly-MAG處理組中有80%以上的293T細(xì)胞可被染成藍(lán)色。

12、　　綜上所述，宜選用10μg/mL Poly-MAG于磁板上作用20min的方法對293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，有80%以上的細(xì)胞普魯士藍(lán)染色呈陽性反應(yīng)，表明這些細(xì)胞內(nèi)存在磁性氧化鐵納米顆粒。使用含600μg/mL或700μg/mL G418的細(xì)胞培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞進(jìn)行篩選后GFP陽性克隆率最高（86.54±2.35%vs90.00±1.49%）。重組蛋白提取純化后經(jīng)濃度和純度檢測，顯示四個蛋白均符合后續(xù)試驗要求。
　　試驗三：

13、應(yīng)用磁性納米技術(shù)介導(dǎo)人源化轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白重編程廣西巴馬小型豬耳皮膚成纖維細(xì)胞成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的可行性研究
　　本試驗旨在探討磁性納米顆粒與轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白的偶聯(lián)效果及其在縮短重組蛋白介導(dǎo)體細(xì)胞重編程時間上的可能性。本試驗利用磁性納米顆粒介導(dǎo)四種轉(zhuǎn)錄因子的重組蛋白進(jìn)入廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細(xì)胞，使其發(fā)生重編程，并以單純使用四種轉(zhuǎn)錄因子的重組蛋白（內(nèi)含9R聚精氨酸）處理豬皮膚成纖維細(xì)胞作為對照，試驗中采用重組蛋白循環(huán)處理法，以

14、便為成纖維細(xì)胞提供持續(xù)的重編程“能量”。為探究所得iPSCs樣克隆的多能性，本試驗采用形態(tài)學(xué)觀察法，堿性磷酸酶（Alkline phosphatase，AKP）染色及Oct4免疫組織化學(xué)染色法對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：
　　使用磁性納米顆粒偶聯(lián)四種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白介導(dǎo)體細(xì)胞重編程獲得的iPSCs克隆數(shù)（86個）顯著高于單純利用含細(xì)胞穿膜肽的轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白介導(dǎo)體細(xì)胞重編程所獲iPSCs克隆數(shù)（54個，P＜0.05）；從形態(tài)上看，所形

15、成的細(xì)胞克隆緊密吸附于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonal fibroblast cells，MEFs）飼養(yǎng)層上，形似“島嶼”狀，且與周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞分界清楚，高倍鏡下可見細(xì)胞克隆的核大而質(zhì)少，細(xì)胞間距非常緊密，與 ESCs相似。細(xì)胞克隆經(jīng) AKP染液作用后，被染為紅棕色；Oc t4免疫細(xì)胞化學(xué)染色后呈紅色，為陽性反應(yīng)，表明所獲得的iPSCs樣克隆具有一定的多能性。此外，在重編程時間上，單純利用含細(xì)胞穿膜肽的轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白

16、介導(dǎo)體細(xì)胞重編程至少需要7周以上才可形成iPSCs，使用磁性納米顆粒偶聯(lián)四種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白獲得iPSCs只需要5周。結(jié)果表明，應(yīng)用磁性納米顆粒不僅可以適當(dāng)提高重編程效率，而且還能縮短重編程的時間。
　　試驗四：含磁性納米顆粒iPSCs的定位富集試驗
　　本實驗旨在驗證：（1）磁性氧化鐵納米顆粒是否存在于 iPSCs內(nèi)；（2）在磁吸作用下，含有磁性氧化鐵納米顆粒的iPSCs是否具有定位富集的能力。本研究對iPSCs集落進(jìn)行了

17、普魯士藍(lán)染色，觀察其顏色變化；并采用外加磁場對培養(yǎng)有 iPSCs培養(yǎng)瓶的下端進(jìn)行吸引，檢測iPSCs在瓶內(nèi)的分布情況。結(jié)果顯示：IPSCs能夠被普魯士藍(lán)染成藍(lán)色，且在外加磁場下可以發(fā)生富集現(xiàn)象，證明其內(nèi)存在有磁性氧化鐵納米顆粒。
　　結(jié)論：在小型豬皮膚成纖維細(xì)胞的獲取中，采用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA先作用30min+再加0.2%膠原酶作用30min的聯(lián)合消化法獲取耳部皮膚成纖維細(xì)胞較好；借助外加磁場，利用表面修飾的磁