K562與K562-A02細(xì)胞株中白血病耐藥相關(guān)microRNA的篩選研究.pdf

1、研究背景：化療是白血病以及其它腫瘤的主要治療手段，隨著化療藥物的廣泛應(yīng)用，腫瘤的耐藥性問題越來越突出，已成為腫瘤化療失敗的主要原因之一。腫瘤多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥性的同時(shí)，對其他多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥。目前有關(guān)腫瘤耐藥機(jī)制的研究主要是從多藥耐藥基因表達(dá)的蛋白入手，探討這些蛋白在形成耐藥機(jī)制中的作用。研究表明，P-gp糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥蛋白、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白、D

2、NA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶等多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)與腫瘤多藥耐藥性相關(guān)。雖然已有的研究揭示了一些腫瘤多藥耐藥機(jī)制，但目前仍然不能完全解釋腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象，臨床上也缺乏逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的有效途徑。 微小RNA（MicroRNA，簡稱miRNA）是一類長約19nt-23nt的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于植物及動(dòng)物中，具有物種及組織特異性，進(jìn)化上高度保守。miRNA可與其靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3' untranslated

3、 regions，3’-UTRs）特異性結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA的翻譯抑制或降解，在細(xì)胞分化、增殖與凋亡、個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝、病毒感染及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面具有重要的生物學(xué)功能。新近，miRNA在腫瘤多藥耐藥中的作用也引起了關(guān)注，與乳腺癌、卵巢癌、胃癌等相關(guān)的多藥耐藥miRNA相繼報(bào)道，但白血病耐藥相關(guān)miRNA的研究在世界范圍內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究擬通過白血病細(xì)胞株及其耐藥株的對比研究，篩選出白血病的多藥耐藥相關(guān)miRNA，首次從miRNA

4、調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)探索白血病耐藥機(jī)制，為進(jìn)一步研究其在多藥耐藥機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。 目的：采用microRNA芯片篩選出K562細(xì)胞及其耐藥株K562/A02細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA，并用熒光定量RT-PCR對篩選出來的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步確定白血病耐藥相關(guān)miRNA。 方法：常規(guī)培養(yǎng)K562及K562/A02細(xì)胞株，取等量K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞，Trizol法分別抽提兩種細(xì)胞的總RNA；通過YM-100（Mi

5、llipore）微離心過濾柱得到片段小于300nt的小RNA，對K562和K562/A02細(xì)胞的小RNA分別進(jìn)行Cy3和Cy5熒光標(biāo)記，然后進(jìn)行microRNA芯片雜交反應(yīng)；采集芯片原始信號值并將圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，將兩芯片的信號值進(jìn)行比對篩選出差異表達(dá)miRNA；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對篩選出的miRNA進(jìn)行可靠性驗(yàn)證，鑒定出白血病耐藥相關(guān)miRNA。 結(jié)果：microRNA芯片結(jié)果顯示，與K562細(xì)胞相比，K5

6、62/A02細(xì)胞中有22條miRNA存在表達(dá)差異（P<0.01），表達(dá)差異在2倍以上的有9條，其中miR-221，miR-155，miR-451表達(dá)上調(diào)；miR-98，miR-181a，let-7f， miR-424，let-7g和miR-563表達(dá)下調(diào)。熒光定量RT-PCR對miR-221，miR-181a，miR-451和let-7f的檢測結(jié)果與miRNA芯片的結(jié)果相符合，miR-451、let-7f在白血病細(xì)胞株表達(dá)差異顯著。